1、书书书黑龙江农业科学 （）：王江旭 基于关联分析的水稻剑叶宽基因定位与分析 黑龙江农业科学，（）：，基于关联分析的水稻剑叶宽基因定位与分析王江旭（黑龙江省农业科学院 科研处，黑龙江 哈尔滨 ）摘要：叶形是影响粳稻光合作用和碳水化合物积累的重要因素之一，而叶宽是决定水稻叶形的核心性状之一。挖掘和利用新的叶宽相关基因 可以进一步丰富分子育种理论，提升叶宽性状遗传改良的效率。本研究利用 份粳稻品种的自然群体，于 年和 年对各品种的剑叶宽进行考察。结合高通量重测序获得的 个高质量多态性 ，对粳稻剑叶宽相关性状进行全基因组关联分析（），共检测到 个关联 ，分布在水稻的 条染色体上，表型贡献率范围为 。其
2、中，在两年间被重复检测到，定位区间在 ，此区段内包含 个基因。关键词：水稻；叶形；剑叶宽；关联分析；主效 收稿日期：基金项目：黑龙江省省属科研院所科研业务费（）；黑龙江省农业科学院院级课题（）；高端外国专家引进项目（）。作者简介：王江旭（），男，博士，助理研究员，从事水稻抗逆分子育种研究。：。长期栽培实践证明，将理想株型与杂种优势相互结合利用是实现 水 稻进 一 步 增产的 重要途径。水稻叶形是水稻理想株型的重要组成部分，也是水稻产量形成的重要性状。同时，叶片形态和分布也影响水稻光能利用效率和干物质积累，与水稻产量紧密相关。叶宽是影响叶片形态特征的主要指标之一，直接决定着水稻叶面积，即光合面积
3、和蒸腾面积，间接决定着水稻叶片卷曲度和披垂度等整体叶形指标。尽管叶片形态对于实现高效光合影响较大，但对于决定叶片形态特征的遗传机制尚不明确，主要通过 定位挖掘目的基因和反向遗传学来解析叶形相关性状形成机制。叶片尺寸主要包括叶长、叶宽、叶面积，其中叶宽是受多基因控制的复杂性状，在水稻 条染色体上分布有大量与之相关的数量性状位点（）。全基因组关联分析（，）以连锁 不 平 衡为 基础，通过群体基因型数据与表型数据检测有效关联位点，可以实现对同一复杂性状多数基因座以及一个基因座上多个等位基因的检测。目前对已克隆的定位于号染色体上的 基因研究较清楚，突变体表现为植株矮化、窄叶，该基因突变影响侧叶生长。通
4、过对 等位基因的研究发现，突变体中与生长素极性运输和叶片发育相关基因表达水平发生改变，在维管组织中高度表达，在细胞分裂及细胞大小调控方面起作用，影响生长素极性运输，促进叶片横向生长。编码一个黄素单加氧酶，过表达 出现根部的过度生长及异常形态，表明 参与生长素的生物合成途径。相较于野生型，突变体 泡状细胞面积减小，但数目增多，表现为叶片窄化卷曲。影响生长素和赤霉素相关信号通路，通过对生长素和蜡生物合成基因表达的表观遗传调控影响叶片形态发生和角质层蜡的形成，植株失水率降低，耐旱性增强，可作为抗逆性研究的重要材料。目前宽叶相关性状研究及定位克隆基因较少，基因调控水稻剑叶宽度，使光合叶面积增大，叶片态
5、势得到改善。与粒长基因 等位，可能与籽粒性状调控相关，发现突变体粒长增加、籽粒充实度提高、产量得到显著增加。所以，本研究通过 和高密度 图谱定位叶宽可靠 ，可以为粳稻良好叶形、理想株型分子育种提供重要参考。材料与方法 材料本研究采用的自然群体由 个粳稻品种构成，均为国内外广泛收集的粳稻资源（附表，详见 码）。群体材料来源于东北农业大学农学院，其中，国内材料主要来自黑龙江、吉林和辽宁等地，国外材料主要来自日本、韩国和俄罗斯等国家。方法 表型测定所有材料于 年种植在黑龙江省哈尔滨市道外区民主乡国家现代农业科技示范展示基地，每份材料种植行，每行 株，行距、株距为 ，单株插秧。所有材料采用统一的常规水
6、肥管理。在齐穗期选取每个品种中间第行，中间部位连续株具有相同形态黑龙江农业科学期的植株作为考察对象，采用托普 活体叶面积测定仪测定剑叶宽（，）。全基因组关联分析使用植物基因组 提取试剂盒提取自然群体叶片的总 ，检测合格后由北京华大公司进行建库和重测序。共计筛选出符合标准的（最小等位基因频率，缺失率 ）个 用于后续分析，前期已经完成了 份粳稻品种的群体结构分析、亲缘关系分析和连锁不平衡分析。采用 软件中的混合线性模型（）进行全基因组关联分析。与性状显著关联 位点的阈值定为 ，该阈值由型误差计算器 软件 计 算 得 出（：）。基于 方法进行重要关联位点的确定：如果两个或两个以上的 位点位于同一个
7、区间内，则将这些 视为同一个 ，值最小的 作为 ，该 的贡献率作为 的贡献率。使用 语言中的 软件包绘制关联分析结果的曼哈顿图和 图。命名方式遵循 等的原则。结果与分析 粳稻剑叶宽表型数据分析 年连续两年对自然群体进行了剑叶宽度测定，结果见表。剑叶宽表型值在两年间表现稳定，两年间变异系数分别为 和 ；说明 该 群 体在叶 宽上具有很大差异。其峰度、偏度绝对值位于附近，符合正态分布，呈现典型的数量性状遗传模式，表现出主基因或多基因控制的数量性状遗传特征，适于进行全基因组关联分析。表两年环境下自然群体的剑叶宽表型值年份剑叶宽 变幅 变异系数偏度峰度 粳稻剑叶宽全基因组关联分析利用 的混合线性模型（
8、），于 年分别对 份粳稻品种的剑叶宽进行全基因组关联分析检测，在 的条件下，共检测到 个与粳稻剑叶形态相关性状显著关联的 （图，图）。表和表列出了与各个性状显著关联的峰值 位置信息，这些 位于 个 区间内，在水稻的 条染色体上均有分布，解释了 的表型贡献率（）。年检测到 个与剑叶宽度显著关联的 ，分布在除号、号、号、号染色体外水稻其他 条染色体上，贡献率范围在 。年检测到 个与剑叶宽度显著关联的 分布在除号、号染色体外水 稻 其 他 条 染 色 体 上。贡 献 率 范 围 在 ，其中 贡献率最高。图 年叶宽全基因组关联分析的曼哈顿图（）和 图（）图 年叶宽全基因组关联分析的曼哈顿图（）和图（）
9、期王江旭：基于关联分析的水稻剑叶宽基因定位与分析表 年自然群体剑叶宽显著关联的 位点 峰值 染色体位置贡献率已知基因 -表 年自然群体剑叶宽显著关联的 位点 峰值 染色体位置贡献率已知基因 -黑龙江农业科学期由表两年的全基因组关联分析数据可知，有个 作为峰值 同时在两年间稳定表达。年检测结果中位于 的 和 年检测结果中 位于 的 被检测到同时控制水稻剑叶叶宽，是全基因组关联分析中唯一一对在两年间重复检测到的稳定 ，把这个 重命名为 。属于调控粳稻剑叶宽的稳定表达 ，位置处在粳稻的第 染色体上，由全基因组关联分析在两年间同时检测到的稳定表达显著关联的 组成。两年定位结果存在一个重叠 的 区 间
10、即 第 号 染 色 体 （、的重合区域），所以认为 极有可能是控制粳稻剑叶宽度的主效 。对该区段内的基因进行统计，发现目标区段共有 个基因，其中包括个功能注释基因、个功能未知的表达蛋白和个反转录转座子蛋白。表共定位 名称及分布 名称染色体原 峰值 贡献率 讨论水稻是一种自花授粉的作物，这往往会导致较大的 衰减距离。全基因组关联分析的分辨率是由所在基因组的 水平和等位基因或单倍型频率所决定的。如果想要减小基因组 衰减的距离，就需要足够多的 标记，与之相应的分辨率也会升高。同时，可以通过不同群体和分析方法结合的手段对候选基因进行综合定位、筛选，进一步缩小选择范围，提升定位精度。本研究通过全基因组关
11、联分析进行粳稻剑叶宽度基因的挖掘，在第 号染色体 区间得到一个两年间稳定表达的重要 。剑叶宽在两年定位结果重复性不佳，可能是因为两年种植地块及气候条件不同所致。一些前人研究中已经定位到的 或克隆出的与叶形相关的基因位于本研究检测到的 区间内部或区间附近。例如，属于 基因超家族，被检测到位于 所在区间附近。是 信号传导的负调控因子，即阻止 信号向下传导。本研究中检测到的 与前人研究中的剑叶宽度 位置重合。前人研 究 中 定 位 到 的 包 含 本 研 究 的 。区间中包含水稻 家族基因 ；区间内含有调控水稻叶倾角的基因 。受体激酶基因 与 本 研 究 叶 宽 位 置 相近。启动子结合蛋白 被检测
12、到与控制粳稻剑叶宽度及剑叶面 积 的 位置相近。调节水稻木质素生物合成和激素稳态的基因 被检测到位于 附近。参与水稻表皮细胞，纵向叶脉发育的锌指 蛋 白 被 检 测 到 与 本 研 究 叶 宽 位置相近，在前人研究中这些基因均被证实参与水稻的叶片宽度调控。等 利用 突变体和 构建分离群体，将候选基因定位在号染色体 的区域内，与本研究中控制剑叶宽位点 位置相近，并通过测序发现 基因内发生核苷酸点突变，导致编码的氨基酸由半胱氨酸替换为苯丙氨酸。进一步实验表明 通过调控离子 平衡以维持细胞渗透势，参与细胞伸长进程并且对水稻叶片发育发挥重要作用。认为 基因在信号传导过程中的连续活动促进内源拮抗的 水平
13、，即促进 的合成且抑制 的合成。研究表明 的信号传导受 蛋白的出现和消失控制，即 达到一定浓度时，蛋白消失，的信号得以传导下去，但 反过来刺激 的转录和翻译，从而抑制 的传导。等 对窄卷叶基因 进行 分 析 验 证 和 克 隆 转 化，研 究 发 现，编码 蛋白，个等位基因突变体都表现出叶宽减小和半卷叶的表型，显微镜分析表明，与野生型相比，突变体具有更少的纵脉和更小的近轴块状细胞，对水稻叶的形态发生和营养发育起着关键作用。除上述水稻叶形相关基因外，还 有 一部分本研究中检测到的 位于前人研究中定位到的与水稻叶形相关的期王江旭：基于关联分析的水稻剑叶宽基因定位与分析 区间内部或附近区间。如本研究
14、定位到的 与 等 利用 和 杂交获得的两个水稻双单倍体（）群体对水稻剑叶形态开展的 定位研究中 几乎完全重合。下一步将会对粳稻第 号染色体 区间内的基因开展单倍型分析、分析、候选基因测序等研究，进一步筛选目的基因，为水稻株型育种提供可靠理论依据。结论本研究采用经过重测序的 个粳稻品种组建的自然群体进行多年际 分析。在 和 年分别定位到 、两个稳 定 表 达 的 叶 宽，重 合 区 间 为 水 稻第 号染色体 ，视为控制水稻叶宽的主效，重命名为 ，此区段内包含 个基因。参考文献：姚栋萍，刘春林，吴丹，等 水稻叶形遗传调控机理的研究进展湖南农业科学，（）：陈洪娟，商晨阳，黄梅艳，等水稻叶片夹角调控
15、机制的研究进展 分子植物育种，：（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（），：，（），（）：，（）：，（）：，（）：，（）：（下转第 页）黑龙江农业科学期 ：，：，：，：，（）：王亚琦，孙子淇，郑峥，等作物分子标记辅助选择育种的现状与展望江苏农业科学，（）：，（）：张延滨，孙连发，辛文利，等主栽小麦品种中 亚基对品质改良的影响中国农业科学，（）：张延滨，赵海滨，宋庆杰，等龙麦 小麦品种中亚基和 亚基近等基因系间的品质差异 中国农业科学，（）：张延滨，辛文利，张春利，等黑龙江省超强面筋小麦的育种策略和方法黑龙江农业科学，（）：吕晓波，张延滨，宋庆杰，等 亚基对超强面筋小麦品质的影响麦类作物学报，（）：韩一军，姜楠 新时期中国粮食安全研究 北京：中国农业科学技术出版社，（，）：，（），（）：；（上接第页）（，）：（），（），：；
