1、 年 月第 卷第 期.，.，收稿日期 基金项目 国家重点研发计划项目（）；贵州省科技支撑计划项目（黔科合支撑 号）；贵州大学人才项目（贵大人基合字 号）通信作者李金玲，博士，副教授，主要从事药用植物营养生理研究，：作者简介 李明松，硕士研究生，主要从事药用植物栽培研究，：资源与鉴定 基于矿质元素和氮稳定同位素比值的金钗石斛栽培模式判别研究李明松，李金玲，赵致，王华磊，罗夫来，罗春丽，杨继勇，丁刚，邓浪（贵州大学 农学院，贵州 贵阳；贵州省药用植物繁育与种植重点实验室，贵州 贵阳；赤水市信天中药产业开发有限公司，贵州 赤水）摘要该研究探讨矿质元素含量和氮同位素比值对金钗石斛栽培模式判别的可行性，
2、以期为金钗石斛栽培模式的判别提供理论支撑。测定大棚栽培、附树栽培、附石栽培 种栽培方式下金钗石斛及其栽培基质样品中 种矿质元素氮（）、钾（）、钙（）、磷（）、镁（）、钠（）、铁（）、铜（）、锌（）、锰（）、硼（）含量和氮同位素比值。结合方差分析、主成分分析、逐步判别分析对不同栽培类型样品进行分类。结果表明，除 元素外，氮同位素比值与其余元素含量在不同栽培类型金钗石斛间均存在显著差异（.）；相关性分析结果表明，金钗石斛中的氮同位素比值、矿质元素含量及药效成分含量与对应栽培基质中的氮同位素比值和矿质元素含量存在不同程度的相关。主成分分析可初步对金钗石斛样品归类，但部分样品存在交叉现象。通过逐步判别
3、分析，筛选出、等 个指标可用于建立金钗石斛栽培方式的判别模型，经回代检验、交叉检验及外部验证的整体正确判别率均为。因此，氮同位素比值和矿质元素指纹结合多元统计分析可有效判别金钗石斛的栽培类型，研究结果为金钗石斛的栽培类型及产地识别提供了一种新的方法，也为金钗石斛的品质评价和质量控制提供实验依据。关键词 金钗石斛；稳定同位素；多元统计分析；判别分析 ，（，；，；，）（，）（，），年 月第 卷第 期.，.，（.），；：.金 钗 石 斛 为 兰 科 石斛属 多年生附生草本植物，富含多糖、生物碱等活性物质，具有提高免疫力、降血糖、抗肿瘤等功效，药用价值极高。金钗石斛作为一种珍稀中药材，对生长环境要求苛
4、刻，生长缓慢，野生资源逐渐枯竭，国家已将其列为重点保护中药材。经过多年探索，金钗石斛人工种植技术已日趋成熟，目前金钗石斛常见的栽培方式主要有大棚离地床栽、仿野生附石栽培、仿野生附树栽培 种模式。本研究测定了 种栽培模式金钗石斛多糖和石斛碱药效成分含量，并结合前人研究成果，结果均表明附石栽培的金钗石斛多糖、石斛碱等成分含量高于附树栽培和大棚栽培，这与本草图经记载的“惟生石上者胜。亦有生栎木上者，名木斛，不堪用”一致。因此，附石栽培金钗石斛因其较高的药效优于其他栽培方式，具有很高的市场价值。目前，市场上存在不同栽培来源的金钗石斛混淆的情况，品质良莠不齐，导致金钗石斛药材品质下降。因此，建立高效精确
5、的金钗石斛栽培模式溯源检测技术，才能有效保证金钗石斛的药材品质，该方法旨在为金钗石斛产业的健康发展提供技术支持。目前，农产品产地溯源手段主要基于化学成分检测，包括近红外（，）和高效液相色谱（，）等技术，但活性成分受加工、贮藏时间等因素影响较大，导致化学成分定性或定量偏差，最终影响产地判别的准确性。此外，基于 指纹分析和 分子标记的溯源技术，亦因其操作难度大、耗费成本高而具有较大的局限性。稳定同位素溯源技术依据同位素自然分馏效应，因受植物体所处外部环境（气候、土壤）及自身新陈代谢的影响，导致不同地域来源植物体的稳定同位素自然丰度值存在差异。此外，植物体矿质元素因其自身不能合成，必须从土壤、水等周
6、围环境中获取，因而带有其产地特有的地理指纹信息。因此，矿质元素指纹和稳定同位素因其分析精度高、操作过程相对稳定且不易受外界因素干扰等优点，近年来已被广泛应用于多种名贵中药材的产地溯源，如当归、何首乌、五味子、决明子等，但在金钗石斛产地及栽培模式溯源方面的研究尚未见报道。因此，本研究通过测定大棚栽培、附树栽培、附石栽培 种栽培方式金钗石斛及其栽培基质中氮同位素比值和多种矿质元素的含量，结合方差分析、主成分分析和逐步判别分析等多元统计分析方法，探讨区分金钗石斛栽培类型的可行性，以期为金钗石斛的栽培类型及产地溯源提供参考依据。材料.研究区概况贵州省赤水市旺隆镇（、），地处赤水市中部是赤水金钗石斛主产
7、区之一，也是赤水金钗石斛核心区。旺隆镇地处河谷半高山丘陵地带，地势东南高、西北低，属亚热带季风气候，海拔 ，根据赤水市气象局查询旺隆镇 年年平均降雨量为.，年平均气温为.。旺隆镇的新春村（、）和鸭岭村（、）金钗石斛种植基地，是赤水市金钗石斛集中连片种植面积最大的基地，也是赤水金钗石斛种植最悠久的基地，个基地距离相隔不远，气候类型差异不大，新春村金钗石斛以大棚栽培为主，鸭岭村以附树栽培和附石栽培为主。李明松等：基于矿质元素和氮稳定同位素比值的金钗石斛栽培模式判别研究.样品采集与处理于 年 月从旺隆镇新春村和鸭岭村金钗石斛种植基地采集栽培基质样品 份，金钗石斛样品 份，经贵州大学农学院赵致教授鉴定
8、为金钗石斛，采样信息见表。新春村种植基地设置大棚栽 培 取 样，栽 培 基 质 主 要 由 马 尾 松 和 香 樟 （）的木屑构成，以 个.的大棚离地厢床为 个样方；鸭岭村种植基地设置附树栽培和附石栽培取样，以 划定样方，样方内的丹霞石和香樟供金钗石斛的样品采集。金钗石斛样品采集：选取已种植 年的金钗石斛，个样方选取长势基本一致的金钗石斛 丛，每丛金钗石斛用剪刀剪掉 枝二年生假鳞茎，去掉叶片，枝假鳞茎混合为 个样品。栽培基质样品采集包括木屑基质及化肥样品：自表面向下挖约 ，据五点采样法采集木屑，个点的木屑采集后混合为 个样品，另外采集大棚栽培喷施用的叶面肥样品。树皮基质：随机选取样方内 颗香樟
9、树，自树皮表面用刀向树干内部刮约.，颗香樟树的树皮混合为 个样品。丹霞石及伴生苔藓：随机选取样方内 块丹霞石，自丹霞石表面用地质锤凿开表层约.，得到块状或粉末状的丹霞石样品，去除根系和其他杂物，并采集丹霞石上的苔藓，个点的丹霞石和苔藓样品分别混合为 个样品。表 样品地域来源信息及药效成分含量 栽培类型样品来源经纬度海拔 样品数量 份药效成分 基质金钗石斛多糖石斛碱大棚栽培（）新春村，.附树栽培（）鸭岭村，.附石栽培（）鸭岭村，.样品预处理包括金钗石斛和苔藓样品：采集到的金钗石斛和苔藓样品先用自来水清洗植株表面杂质，后用去离子水冲洗 遍，杀青，烘至恒重，烘干样品用中药粉碎机进行粉碎，所有样品平均
10、分为 份，分别过 目筛（矿质元素检测）和 目筛（氮稳定同位素比值检测）后装袋，待测。木屑和树皮基质样品：将木屑、树皮基质样品置于 烘箱中烘至恒重，所有样品粉碎后分别过 目筛和 目筛后装袋，待测。丹霞石和叶面肥样品：采集到的丹霞石和叶面肥样品置于室内风干，用研钵研磨过 目筛后装袋，待测。.仪器与试剂 同位素质谱仪（公司，美国），型电感耦合等离子体质谱仪（公司，美国），全自动凯氏定氮仪（上海赫冠仪器有限公司），型等离子体发射光谱仪（公司，美国），波长色散 射线荧光光谱仪（帕纳科公司，荷兰）。钾（，编号）、钙（，编号）、磷（，编号）、镁（，编 号）、钠（，编号）、铁（，编号）、铜（，编 号）、锌（，
11、编号）、锰（，编号）、硼（，编号）各元素对照品均由国家有色金属及电子材料分析测试中心提供，所用试剂均为国产分析纯。方法.氮稳定同位素比值检测金钗石斛和基质样品经提纯、干燥前处理后，用洁净锡杯包裹，自动进样器进样，在 反应器中与氧 气 反 应 生 成，经 氦 气 流（.）的带动下，通过吸附和解吸附分离纯化后通过石英毛细管进入同位素质谱仪。工作标准为国际原子能机构标准物质，样品分析精度优于.。氮稳定同位素比率计算公式如下。样品 标准标准 式中 样品为所测样品中重同位素与轻同位素丰度比，即，标准为国际标准样中重同位素 年 月第 卷第 期.，.，与轻同位素丰度比，的参照标准为大气。.丹霞石矿质元素检测
12、.电感耦合等离子体质谱仪（）测定 和 元素含量 准确称取 丹霞石样品置于消解罐中，加入 氢氟酸和.硝酸，将消解罐放入 烘箱中加热 ；冷却后将消解罐置于电热板上加热至近干，再加入.硝酸蒸发至干，重复操作此步骤 次；再次加入 硝酸，密封，放入 烘箱加热 ，冷却后取出消解罐，将溶液转移至塑料瓶中，超纯水定容至 ，备测。仪器参数：功率为 ，冷却气流速为 ，雾化器流速为.，辅助气流速为.，扫描方式为跳峰，测量时间 ，扫描次数 次。.射线荧光光谱仪测定、元素含量称取.丹霞石样品，精确至.，置于 瓷坩埚中，加入.无水四硼酸锂、.氟化锂和.硝酸铵搅拌均匀，再加入 溴化锂溶液，置于电热板上烘干；将坩埚置于自动火
13、焰熔样机上，以丙烷为燃气，在 熔融 ；将熔融物倾入至已加热至 铸模中浇铸成型，取出样片在 射线荧光光谱仪上进行测量。射线荧光光谱仪测量条件：射线管电压为 ，电流为 ，粗狭缝，视野光栏直径为 。.凯氏定氮仪测定氮（）元素含量按照 年版中国药典通则 蛋白质含量测定法中的凯氏定氮法测定 元素含量。.金钗石斛、木屑基质与树皮基质矿质元素检测 元素含量采用凯氏定氮仪测定；、元素含量采用等离子体发射光谱仪（）测定。.金钗石斛多糖、石斛碱含量测定多糖含量测定参照颜寿等的方法。配制质量浓度为.的无水葡萄糖对照品溶液，采用苯酚硫酸显色，在 波长处测定吸光度。试验结果表明，对照品溶液质量浓度在.线性关系良好，标准
14、曲线为 .，.。石斛碱含量测定参照 年版中国药典气相色谱法（通则）测定。配制质量浓度为.的石斛碱对照品溶液，吸取 ，注入气相色谱仪，记录石斛碱的色谱图。色谱柱型号为 毛细管柱，程序升温：初始温度为 ，以每分钟 的速率升温至 ，保持 ；进样口温度为，检测器的温度是 ；载气为氮气；分流比为；氢气的流速 ；空气的流速 ；尾吹气流速 。理论塔板数不低于 。每个样品重复测定 次。以浓度为横坐标，峰面积比值（各浓度对照品溶液峰面积内标物峰面积）为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线方程为.，.，说明石斛碱在.具有良好的线性关系。.数据分析使用 .软件分析获得的数据。首先，对金钗石斛和基质样品的每个元素及 进行单
15、因素方差分析，然后采用多元统计分析中主成分分析和逐步判别分析对不同栽培方式来源样品进行分类，使用 .软件进行作图。结果与分析.金钗石斛及栽培基质矿质元素特征分析.不同栽培基质矿质元素特征分析不同栽培模式金钗石斛及其栽培基质 种矿质元素含量见表。结果表明，木屑、树皮与丹霞石 种栽培基质矿质元素含量有其各自的特征。丹霞石、木屑、树皮的 种元素含量存在差异，其中、种元素在丹霞石中含量最高，均显著高于木屑和树皮（.）；而、元素含量最低，分别为.、.，元素含量显著低于木屑和树皮（.），元素含量显著低于树皮（.），与木屑未达到差异显著水平。种元素在木屑和树皮中含量差异不大，除、种元素含量达到显著差异（.）
16、，其余元素含量差异均未达到显著水平。这与木屑原料来源有关，木屑原料来源于樟树、松树等树木，因此，导致 种基质元素含量差异不明显。.不同栽培模式金钗石斛矿质元素特征分析、种元素在附树栽培下含量最高，附石栽培次之，大棚栽培最低，而、种元素在大棚栽培中含量最高；和 种元素含量附石栽培大棚栽培附树栽培，见表。统计分析表明，除 元素以外，其余元素在不同栽培模式间含量差异均达到显著水平（.）。李明松等：基于矿质元素和氮稳定同位素比值的金钗石斛栽培模式判别研究表 金钗石斛及栽培基质矿质元素含量（?）（?）金钗石斛 栽培基质木屑（）.树皮（）.丹霞石（）.栽培方式大棚栽培（）.附树栽培（）.附石栽培（）.金钗石斛 栽培基质木屑（）.树皮（）.丹霞石（）.栽培方式大棚栽培（）.附树栽培（）.附石栽培（）.注：不同小写字母表示差异显著，.（表 同）；未检测。.金钗石斛及栽培基质 特征分析不同栽培模式金钗石斛及栽培基质 见表，栽培基质 在木屑中最高，丹霞石次之，树皮最小，同位素比值的算术平均值依次为.、.、.，单因素方差分析结果表明 种栽培基质的 间均存在显著差异（.）。附石栽培下金钗石斛会伴生苔藓植物，苔
