1、中国国境卫生检疫杂志2023年2月第46卷第1期Chinese Frontier Health Quarantine Feb.2023，Vol 46，No.1志贺菌属是一类革兰阴性杆菌，由志贺菌属引起的细菌性痢疾主要表现为腹泻、里急后重等1。据统计，全球每年细菌性痢疾病例高达1.65亿，死亡人数约为110万，在不发达国家和发展中国家较为严重，是重要的公共卫生问题2，因此对志贺菌的检测至关重要。我国现行的国家标准GB 4789.52012食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验通过增菌、分离、生化实验以及血清学鉴定对食品中志贺菌进行检测3，准确性高，但操作繁琐、耗时长。Li等以环介导等温
2、扩增技术为基础，针对志贺菌属侵袭性质粒抗原H（ipaH）基因序列设计引物，检测食源性志贺菌，灵敏度达到43 CFU/ml4。Ma等则将免疫磁珠分离与多重荧光定量PCR相结合，建立了Study on rapid detection of Shigella DNA based on hybridizationchain reactionZHONG Xinyi*，ZHUANG Miaohui，YANG Qiling，YANG Huan，HU Shanwen*School of Public Health，Fujian Medical University，Fuzhou，Fujian 350122，C
3、hinaAbstract：ObjectiveTo establish a novel method for rapid detection of Shigella DNA based on hybridization chainreaction.MethodsThe specific nucleic acid sequence of Shigella CssrB gene was used as target，the hairpin probelabeled with FAM fluorescent group was opened to generate the fluorescence s
4、ignal，which was amplified by thespecially designed hybridization chain reaction.The reaction conditions were optimized，the stability and selectivity ofShigella were evaluated.The coordination between the fluorescence signal and the target concentration was established.The effectiveness of the method
5、 was evaluated by quality control testing and analysis the Shigella level on thesurface of citrusfruit samples.ResultsThe reaction conditions were optimized that the salt concentration of 0.2 mol/LNa+，1 mmol/L Mg2+.The fluorescence signal RSD=0.12%was measured in parallel，and Helicobacter pylori，Esc
6、herichiacoli and Staphylococcus aureus didnt produce interference signal.This method had a good linear relationship inrange of 0.001-500 nmol/L of Shigella target nucleic acid concentration.The detection limit was 0.001 nmol/L（converted to 0.015 g/L）.The method had a good accuracy through the qualit
7、y control testing and no Shigella wasdetected in the simulated sample.ConclusionThe detection based on rapid hybridization chain reaction can detectShigella DNA sensitively，stably and specifically，which provides a novel way for Shigella detection.Keywords：Shigella；Hybridization chain reaction；Rapid
8、detection论著基于杂交链式反应的志贺菌核酸快速检测研究钟心怡1，庄妙慧2，杨琪玲1，杨欢1，胡善文11.福建医科大学公共卫生学院，福建 福州350122；2.厦门国际旅行卫生保健中心（厦门海关口岸门诊部）摘要：目的建立一种以杂交链式反应为基础的快速检测志贺菌核酸的新方法。方法以志贺菌CssrB基因的一段特异性核酸序列为靶标，设计带有FAM荧光基团标记的发卡探针，利用杂交链式反应扩增靶标序列；优化反应条件，评价信号的稳定性和选择性，绘制荧光信号与靶标浓度的工作曲线；通过人工质控检测及柑橘类水果实际样品检测验证方法的有效性。结果建立的方法经优化得到反应条件为0.2 mol/L Na+、1
9、mmol/L Mg2+的盐浓度，经平行测定荧光信号，RSD=0.12%，并且幽门螺杆菌、大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌均不对其产生干扰信号，表明方法具有良好的稳定性和选择性；在志贺菌靶标核酸浓度为0.001500 nmol/L范围内具有良好的线性关系，检出限为0.001 nmol/L（换算为0.015 g/L）；通过质控检测发现方法具有较好的准确性，且实际样品中未检出志贺菌。结论基于杂交链式反应的检测方法可以灵敏、稳定、特异性地检测志贺菌核酸，为志贺菌检测提供了一种新途径。关键词：志贺菌；杂交链式反应；快速检测中图分类号：R183.4文献标识码：ADOI：10.16408/j.1004-9770.
10、2023.01.001基金项目：福建省自然科学基金项目（2020J01637）通信作者：胡善文，E-mail：1中国国境卫生检疫杂志2023年2月第46卷第1期Chinese Frontier Health Quarantine Feb.2023，Vol 46，No.11.3.2荧光检测条件优化盐浓度、反应时间影响碱基互补配对，进一步影响发卡结构H1、H2的形成，是核酸反应过程中的关键因素，故对荧光检测中的盐浓度、反应时间作优化。1.3.2.1钠离子（Na+）浓度优化配制含0.01、0.05、0.08、0.2、0.3 mol/L的Na+离子的PBS（Mg2+浓度为5 mmol/L），并用其分别
11、稀释H1、H2和志贺菌靶标DNA至10 mol/L退火，孵育并测定荧光信号。1.3.2.2镁离子（Mg2+）浓度优化用含有0.5、0.8、1、3、7 mmol/L的Mg2+的PBS（Na+为0.2 mol/L）分别稀释H1、H2和志贺菌靶标DNA至10 mol/L退火，孵育并测定荧光信号。能快速有效检测新鲜猪肉中志贺菌的方法，检出限低至6.8 CFU/g5。为探索更加简便的检测方法，Wang等结合多重交叉位移扩增技术和横向流动生物传感器对志贺菌进行检测，减少了特殊试剂以及昂贵仪器的使用，可在1 h内完成，适用于即时检测6。徐颖等通过设计特异性引物，建立检测志贺菌的重组酶聚合酶扩增方法，为志贺菌
12、的快速检测提供了新的思路7。杂 交 链 式 反 应（hybridization chain reaction，HCR）是一种无酶参与的核酸信号放大技术，背景干扰低，具有较好的特异性和稳定性8，已用于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门菌的检测9-10。尽管随着大众对食品安全愈发关注，志贺菌的检测技术得到一定程度的发展，但依旧存在各自的短板，方法的简便性、灵敏度、特异性以及成本仍需要改善。荧光检测技术具有成本低廉、操作简便、检测效果及分析结果灵敏、快速等优点，在食品安全检测中得到大量的开发应用11，故本研究以杂交链式反应为基础，对目标分子进行捕获和信号放大，通过检测荧光信号的大小定量检测食品中的
13、志贺菌。1材料与方法1.1仪器HB120-S LED数显加热金属浴；日立F-4500荧光光谱仪。1.2材料1.2.1试剂氯化钠（NaCl）、氯化镁（MgCl2）、过硫酸铵、N-羟基琥珀酰胺、1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二胺盐酸盐均由上海麦克林生化有限公司生产；1PBS（磷酸盐缓冲溶液）、5TBE（Tris-硼酸电泳缓冲液）、30%丙烯酰胺、Gelgreen染液、N，N，N，N-四甲基乙二胺、DNA提取液、NC滤膜由上海生工公司生产；20bp DNA分子量标准由宝日医生物技术有限公司生产。1.2.2序列以志贺菌CssrB基因的一段特异性核酸序列为靶标DNA，设计发卡结构探针，分别命名为
14、发卡探针1（H1）和发卡探针2（H2）。幽门螺杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的靶标序列用于验证方法的选择性。所有靶标序列及探针均由南京金斯瑞生物科技有限公司人工合成。序列见表1。1.3方法1.3.1凝胶电泳验证核酸反应制备电泳凝胶，按照表2顺序加样，电压100 V条件下电泳1 h。电泳结束后，避光下Gelgreen染液染色15 min并成像。表1本研究所用核酸序列Tab.1DNA sequences used in this study细菌/探针Bacteria/probe序列（5-3）Sequence（5-3）志贺菌CCGCAGCACGTTCTTGCTTATGCATH1FAM-CCGCAGC
15、ACGTTAGGTAGCCTGAACTGAATGCATAAGCAAGAACGTGCTGCGG-BHQH2FAM-TCAGTTCAGGCTACCTAATGAACCGCAGCACGTTCTTGCTAGCCTGAACTGA-BHQ幽门螺杆菌CGGCAAGACGGAAAGACCCCGT大肠杆菌CGGGATCATCATGGCTTTCAGTAAA金黄色葡萄球菌CGGACGAGAAGCTTGCTTCTCT表2DNA凝胶电泳加样表Tab.2Sampling information in PAGE assay泳道Lane12345678样品DNA分子量标准H1H2靶标DNAH1+靶标DNAH2+靶标DNAH1+
16、H2H1+H2+靶标DNA2中国国境卫生检疫杂志2023年2月第46卷第1期Chinese Frontier Health Quarantine Feb.2023，Vol 46，No.11.3.2.3反应时间用含有0.2 mol/L Na+和1 mmol/LMg2+的PBS稀释H1和靶标DNA至1 mol/L退火，取100 l（1 mol/L）的靶标DNA与H1混匀，立即测定荧光信号，重复扫描直至荧光信号稳定，记录反应时间。1.3.2.4荧光分析仪条件狭缝55 nm和510 nm，电压700 V和950 V，激发光波长495 nm，测定范围510700 nm。1.3.3选择性和稳定性验证准备志贺菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、幽门螺杆菌的DNA各200 l，其中志贺菌靶标DNA、H1、H2的终浓度为500 nmol/L，待孵育完成后进行荧光检测。并对志贺菌DNA的平行样品进行测定，计算相对标准偏差评价方法的稳定性。RSD=（X-X?）2/（n-1）X?（X：荧光信号值；n：样品数）。1.3.4工作曲线测定取100 mol/L志贺菌靶标DNA、H1、H2，用PBS（含0.2 mol/L N
