1、第 46 卷第 1 期2023 年 1 月河 北 农 业 大 学 学 报JOURNAL OF HEBEI AGRICULTURAL UNIVERSITYVol.46 No.1Jan.2 0 2 3基于转录组测序分析 SPACA1 在版纳微型猪近交系 睾丸中的表达及转录调控特征刘志朋1，张 霞2，代红梅1，杨福华1，廖隽锐1，许 静1，霍金龙1（1.云南农业大学 动物科学技术学院，云南 昆明 650201；2.吕梁学院 生命科学系，山西 吕梁 033001）摘要：旨在分析版纳微型猪近交系（Banna mini-pig inbred line，BMI）SPACA1 基因的序列特征、生物学功能及在睾
2、丸中的表达调控模式。选取 4 头成年 BMI 公猪的睾丸进行全转录组测序，获得 SPACA1 基因在睾丸中的表达丰度。采用 RT-PCR 技术克隆 SPACA1 的完整编码序列，分析 SPACA1 的序列、染色体定位、分子特征及相应蛋白的结构和功能。对 SPACA1 的相互作用蛋白进行 GO、KEGG 功能富集，并将获得的蛋白与转录组测序所获得的基因表达量进行关联分析。利用转录组测序数据构建 SPACA1 mRNA 与 miRNA 和 lncRNA 的ceRNA 调控网络。SPACA1 基因 CDS 区全长为 888 bp（Genbank 登录号：OK042308），具有 2 个跨膜螺旋结构，
3、与 SPACA3、SPACA4、HIPK4 和 CCDC62 显著相关；SPACA1 及其互作蛋白主要参与精子细胞发育、分化，精子活力、顶体反应和精子鞭毛形成等通路；SPACA1 基因受 6 个 miRNAs 靶向调控。本研究报道了 SPACA1的表达、分子结构、蛋白质功能、在睾丸中的和转录调控作用，为深入研究 SPACA1 基因在 BMI 受精以及顶体反应等重要生物学过程中的功能奠定基础。关 键 词：精子顶体膜相关蛋白 1；蛋白互作；功能分析；ceRNA 转录调控中图分类号：S828.3 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：文献标志码：ATranscriptomic analysis o
4、f expression and transcriptional regulation of SPACA1 in the testes of Banna mini-pig inbred lineLIUZhipeng1,ZHANGXia2,DAIHongmei1,YANGFuhua1,LIAOJunrui1,XUJing1,HUOJinlong1(1.College of Animal Science and Technology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China;2.Department of Life Sciences,L
5、yuliang University,Lvliang 033001,China)Abstract:This study analyzed the sequence characteristics,biological functions and expression regulation pattern of SPACA1 gene in the testis of Banna mini-pig inbred line(BMI).The testis samples of four adult BMI boars were collected for whole transcriptome s
6、equencing to obtain the expression abundance of SPACA1 gene.The complete coding sequence of SPACA1 was cloned by RT-PCR,and the sequence,chromosome location,molecular characteristics,structural and functions of the corresponding protein were analyzed.The interacting proteins of SPACA1 were enriched
7、using GO and KEGG,and the correlation analysis was performed between the proteins and 收稿日期：2022-08-22基金项目：国家自然科学基金项目（32060733）；吕梁学院博士科研启动基金项目.第一作者：刘志朋（1997），男，云南曲靖人，硕士研究生，从事猪分子遗传育种和生殖生理研究.E-mail:通信作者：霍金龙（1975），男，山西五寨人，教授，博士，从事猪分子遗传育种和生殖生理研究.E-mail:本刊网址：http:/文章编号：1000-1573(2023)01-0088-09DOI：10.1332
8、0/ki.jauh.2023.001389第 1 期the gene expression abundance.Transcriptome data were used to construct the ceRNA regulatory network among mRNA,miRNA and lncRNA of SPACA1.The full-length CDS of SPACA1 was 888 bp(Genbank accession number:OK042308),and SPACA1 protein contained two transmembrane helix struct
9、ures.SPACA1 significantly correlated with SPACA3,SPACA4,HIPK4 and CCDC62.SPACA1 and its interacting proteins were mainly involved in germ cell development,spermatid differentiation,sperm motility,acrosomal vesicle and sperm flagellum.BMI SPACA1 gene was targeted by six miRNAs.Overall,our study provi
10、ded comprehensive information on the expression,molecular structure characteristics,protein functions,and transcriptional regulation of SPACA1 in testis,laying a foundation for further study on the functions of SPACA1 gene in important biological processes such as BMI fertilization and acrosome reac
11、tion.Keywords:sperm acrosome membrane-associated protein 1(SPACA1);protein-protein interaction;functional analysis;ceRNA transcriptional regulation顶体是处于精子头前段的膜相帽状结构，顶体反应的诱导是哺乳动物成功受精的必要条件之一，顶体反应的生物学过程极其复杂，在睾丸中，顶体是由高尔基体产生的前顶体颗粒融合成一个大的顶体颗粒，然后呈现出成熟的物种特异性构象1。SPACA1（SAMP32），是精子顶体相关家族成员之一，最初由 Hao 等2在人类精子的提
12、取物中发现，并证明该蛋白是 1 种睾丸特异性的跨膜糖蛋白，与顶体内膜和精子顶体的赤道段有关。SPACA1 是公猪和公羊精子赤道段的主要酪氨酸磷酸化蛋白，在精卵融合中发挥作用3。卵母细胞成功受精不仅需要精子顶体的形态完整性，而且需要正常的分子结构。在雄性小鼠中敲除 SPACA1 基因，会导致成熟精子中顶体变性和消失，精子分化结构缺陷，甚至头部形成异常，最终影响精-卵融合4。顶体畸形或丧失会患球形精子症，该疾病是一种精子发生过程缺陷引起的不育综合症5。该病症的家族性遗传倾向较为严重，其主要受数量性状影响6。SPACA 家族中的 SPACA3 已被证明是 1 种溶菌酶样蛋白，并对 N-乙酰氨基葡萄糖
13、的寡糖具有保守的底物结合性，可与卵黄周围的透明质酸或相关分子结合7。SPACA4 是 1 种糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白，具有类似于尿激酶纤溶酶原激活物受体超家族的功能域，SPACA4 能作为顶体膜受体，参与顶体膜的蛋白水解或粘附8。在 SPACA 家族中，SPACA3 和 SPACA5 具有很强的氨基酸同源性，SPACA7 蛋白在顶体反应过程中释放并参与受精9。版 纳 微 型 猪 近 交 系（Banna mini-pig inbred line，BMI）是自 1980 开始建系培育的高度近交群体，其在生命科学研究领域具有重要价值，是猪-人异种器官移植的良好供体10，急需扩繁群体数量来满足市场需求，
14、然而相对于其他地方品种猪，其繁殖力整体偏低，且出现了部分公猪不育现象，严重制约了其种群扩大，有悖市场需求。研究雄性育性相关基因的表达调控，对于理解 BMI 睾丸发育、精子发生、顶体反应的分子机制具有重要意义，不仅可以为探寻 BMI 公猪不育机制奠定基础，也可为困扰人类男性不育问题的解决提供借鉴。本研究以 BMI 睾丸组织为材料，分离 SPACA1 基因，分析其分子特征及互作蛋白，对其进行功能注释并构建ceRNA 网络，获得调控其的 miRNAs，结果可为进一步解析 SPACA1 调控 BMI 受精过程尤其是顶体反应过程的分子机制奠定基础。1 材料与方法1.1 基因扩增及序列测定采集 4 头 1
15、2 月龄 BMI 成年公猪的睾丸，提取总 RNA，送天津诺禾致源科技有限公司进行转录组测序筛选到高表达的精子发生相关基因SPACA1，其 对 应 Ensembl 中 猪 SPACA1 201 转录 本 ENSSSCT00000004763.4，利 用 R 包 Gviz对其表达丰度进行可视化。根据该转录本序列设计引物（F:CCGAGAACCATGAGCC；R:CGCTCTAATCTCCTTTGGTTT），使 用 Takara 公司的 Premix TaqTM扩增 SPACA1 基因。反应总体积25 L，其中 Premix 12.5 L，10 mol/L SPACA1 的F/R 引物各 1 L，5
16、0 ng/L 的睾丸 cDNA 1 L，用H2O 补足体积；扩增程序：94 5 min；94 30 s，55 45 s，72 60 s，循环 30 次；72 5 min。1.2 SPACA1 功能分析用 Lasergene 7.1 软 件 读 取 测 序 峰 图 获 得SPACA1 完 整 CDS 序 列；用 ProtParam 分 析SPACA1 的分子量、分子式及等电点等基本参数；用 SMART、SOPMA、ProtScale、TMHMM 和刘志朋，等：基于转录组测序分析 SPACA1 在版纳微型猪近交系睾丸中的表达及转录调控特征90第 46 卷河 北 农 业 大 学 学 报SignalP 分别分析 SPACA1 蛋白质的功能域、二级结构、疏水结构、跨膜螺旋结构及信号肽，用I-TASSER预测 SPACA1 蛋白的三级结构，用 MEGA11 构建SPACA1 多物种氨基酸系统发育树。1.3 SPACA1 相关蛋白互作分析使用 String 11.5 进行蛋白互作网络分析，并将获得的蛋白使用 R 包的 clusterProfiler 进行 GO 和KEGG 功能富集，规定 P 值小于
