1、浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis，2023，35(1):90 102http:/www zjnyxb cn熊兴伟，王艺琴，田怀志，等 基于转录组测序解析南瓜子叶黄化的分子机理J 浙江农业学报，2023，35(1):90 102DOI:10.3969/j issn 1004-1524.2023.01.10收稿日期:2022-03-30基金项目:贵州省科技计划(黔科合成果 2021 一般 063，黔科合成果 2020 1Z002 号);国家重点研发计划(2021YFD1100301)作者简介:熊兴伟(1996)，男，侗族，贵州石阡人，硕士研究生，主要从事
2、蔬菜生理生态与生物技术研究。E-mail:gdxxwei163 com*通信作者，耿广东，E-mail:genggd213163 com基于转录组测序解析南瓜子叶黄化的分子机理熊兴伟，王艺琴，田怀志，张素勤，耿广东*(贵州大学 农学院，贵州 贵阳 550025)摘要:为研究南瓜叶色黄化突变的机制，挖掘黄化相关关键基因，试验以南瓜自然黄化突变体为试材，通过高通量 RNA 测序(RNA-seq)对苗期子叶进行转录组分析。结果表明:从检测的 26 445 个表达基因中鉴定出12 687 个差异表达基因(DEGs)，包括 6 444 个上调基因，6 243 个下调基因;其中 2 321 个 DEGs
3、是转录因子编码基因。选取 14 个与光合色素密切相关的 DEGs 进行实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)分析，发现它们的基因表达水平与转录组测序结果一致。经 KEGG 富集分析，发现卟啉和叶绿素(Chl)生物合成、光系统、光系统、光合作用-天线蛋白、电子传递和 F 型 ATP 酶相关基因的表达显著下调。谷氨酰-tRNA 还原酶、镁离子螯合酶、叶绿素 a 加氧酶基因异常表达，血红素代谢相关基因表达上调抑制了 Chl 合成;-胡萝卜素 3-羟基酶促进了类胡萝卜素生成;另外，光合作用过程受阻也反馈抑制 Chl 合成，Chl 合成受阻和类胡萝卜素合成受促导致南瓜叶色黄化。研究结果为南瓜黄化突变的分
4、子机制提供了新的见解，为关键基因功能分析和南瓜育种奠定了基础。关键词:南瓜;黄化突变体;叶绿素;转录组;基因表达中图分类号:S642.1文献标志码:A文章编号:1004-1524(2023)01-0090-13Molecular mechanisms of chlorophyll-reduced cotyledon based on transcriptome sequencingin pumpkinXIONG Xingwei，WANG Yiqin，TIAN Huaizhi，ZHANG Suqin，GENG Guangdong*(College of Agriculture，Guizhou U
5、niversity，Guiyang 550025，China)Abstract:In order to explore the mechanisms of chlorophyll-reduced mutation and excavate its key genes，pumpkinnatural chlorophyll-reduced seedling was used as test material，and the transcriptome of the cotyledon was analyzedby high-throughput RNA sequencing(RNA-seq)The
6、 results showed that 12 687 differentially expressed genes(DEGs)were identified from 26 445 expressed genes，including 6 444 up-regulated genes and 6 243 down-regulatedgenes Among them，2 321 DEGs were transcription factor genes Fourteen DEGs closely related to photosyntheticpigments were selected for
7、 qRT-PCR analysis It was found that their expression level was consistent with the tran-scriptome data KEGG enrichment analysis showed that the expression levels of biosynthesis of porphyrin and chloro-phyll(Chl)，photosystem，photosystem，photosynthesis antenna protein，electron transport，and F-type AT
8、-Pase related genes were significantly down-regulated Abnormal expression of glutamyl tRNA reductase，magnesiumchelatase，and chlorophyll a oxygenase，and up-regulated expression of heme-related genes inhibited Chl synthesis-carotenoid 3-hydroxylase promoted carotenoid synthesis In addition，feedback of
9、 photosynthesis inhibition also re-duced Chl synthesis The inhibition of Chl synthesis and the promotion of carotenoid synthesis led to pumpkin leaf e-tiolation It laid a new foundation for the molecular analysis of pumpkin mutation and gene functionKey words:pumpkin，chlorophyll-reduced mutant，chlor
10、ophyll，transcriptome，gene expression蜜本南瓜属葫芦科南瓜属，是中国南瓜(Cu-curbita moschata)栽培种中品质较好的品种之一1。植株在苗期与快速生长期易发生自然黄化，影响植株的叶绿素(Chl)含量和光合效率，导致植株生长异常甚至死亡，造成作物减产2。自然界黄化突变体植株的发生主要受叶绿体和光合作用的共同影响，但具体的突变机制复杂，主要涉及叶绿体基因突变、Chl 合成基因突变与激素失调等过程3 4。Chl 主要分布在叶绿体类囊体膜中，是捕光复合体的主要组成部分，在光合作用中起着重要作用5。从谷氨 酰 胺-tRNA(Glu-tRNA)开始到 Chl
11、 a 和 Chl b 的合成包括 15个步骤，涉及 27 个基因和 15 种酶。其生物合成与叶片颜色形成、叶绿体发育过程同时发生，每一步酶基因突变都会影响 Chl 的合成，导致植株颜色改变6 7。目前，在许多植物中发现基因突变而导致植株颜色变化的现象，如拟南芥8、芝麻9、水稻10、红掌11、黄瓜12、烟草13 等。叶片突变有利也有害，如水稻、小麦等作物的叶色突变影响着种子的成苗率14 15;而烟草、茶叶或花卉等叶色突变，通常可以创造性状优良的品种，产生较好的经济效益13，16 17。近年来转录组测序(RNA-seq)已广泛应用于生物学研究，它可从整体水平研究基因的结构和功能，研究某一生物现象或
12、生物过程的分子机理，并可用于差异表达基因分析、基因突变检测、遗传图谱绘制等18，是进行组学研究的重要手段。Lyu 等19 通过高通量转录组分析自然黄化突变的栾树，鉴定了 9 个参与 Chl 代谢和14 个参与类胡萝卜素生物合成途径的候选基因。Jiang等20 对兰花叶色突变体进行转录组测序，鉴定了与光系统相关的 7 个基因，其中 6 个基因上调表达，1 个基因(psbA)下调表达;该研究表明，在一定培养条件下，可能产生影响光系统 D1 蛋白的叶色突变体。Wu 等21 研究黄叶银杏突变体发现，158_mature 和 gma-miR2118a-3p 靶基因参与色素生物合成，151_mature、
13、ptc-miR396e-3p和 aly-miR156a-5p 可能是叶色突变的关键调控因子。汪端华等22 在中国南瓜中分离筛选到稳定遗传银叶突变体 48a，可作为标记性状应用于育种。但南瓜自然黄化突变鲜见报道，在分子机理方面研究更少。南瓜幼苗颜色变异可作为研究 Chl 合成与代谢23、光合系统中基因功能及其调控机制的理想材料，也是典型的分子育种材料。因此，本课题组以南瓜黄化突变体为试材，利用 RNA-seq 技术，探索南瓜叶色黄化的分子机制，以期为基因挖掘和标记开发提供参考，为南瓜高效育种奠定理论依据。1材料与方法1.1植物材料南瓜黄化苗(MB21M)为蜜本南瓜的自然突变株(图 1)，材料来源
14、于贵阳金黔农业科技有限公司，通过实验室组织培养保存。突变株表型为全株黄色，在子叶平展期之前正常生长。在南瓜幼苗第一片真叶初展时，分别剪取黄化苗与正常绿苗(MB21CK)的子叶，立即用液氮速冻后放于80 保存备用。试验设置 3 次重复。MB21M黄化苗子叶取样后一周死亡，无法产生少量叶绿素以供光合作用，而对照绿苗正常生长。1.2试验方法A，MB21M 黄化苗;B，MB21CK 绿苗对照。A，Chlorophyll-reduced seedling MB21M;B，Control green seed-ling MB21CK图 1南瓜黄化苗Fig 1Chlorophyll-reduced seed
15、lingof pumpkin19熊兴伟，等 基于转录组测序解析南瓜子叶黄化的分子机理1.2.1RNA 提取、cDNA 文库构建和测序使用 TRIzol试剂盒 天根生化科技(北京)有限公司 提取南瓜子叶样品的总 RNA。用带有Oligo dT 的磁珠富集有 poly A 尾巴的 mRNA，用DNA 探 针 杂 交 rRNA，DNA/RNA 杂 交 链 用RNaseH 选择性消化，再用 DNase消化 DNA 探针，纯化获得 mRNA。将 mRNA 片段化，用随机N6 引物进行反转录形成双链 cDNA，cDNA 末端补平并在 5端磷酸化，3端形成一个突出“A”的黏性末端，再连接一个突出“T”的鼓泡
16、状接头。连接产物通过特异引物进行 PCR 扩增，PCR 产物热变性成单链，再用一段桥式引物将单链 cDNA环化得到单链环状 cDNA 文库，由华大基因股份有限公司(深圳)使用 Illumina HiSeqTM 2500 平台进行高通量测序。1.2.2差异表达基因(DEGs)筛选使用华大 SOAPnuke 软件进行过滤。首先去除包含接头的 reads(接头污染)，接着去除未知碱基 N 含量大于 5%的 reads，再去除低质量的reads(质量值低于 15 的碱基占该 reads 总碱基数的比例大于20%的 reads)，得到 clean reads;使用HISAT 将 clean reads 比对到南瓜参考基因组(Cucurbita_maxima_v1.1)序列。根据 FPKM(每千碱基转录物每百万次映射读取的片段数)方法分析基因表达水平。DEGs 筛选条件为错误发现率(FDR)0.05 和|log2fold change|(|log2FC|)1。1.2.3DEGs 功能注释与实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)验证采用 BLASTx 将 unigene 序列与公开的蛋白质数据库进行
