1、68中国果树，2023（2）：68-73本文于 2022-04-07 收到，2022-05-18 收到修改稿。*河北省农林科学院基本科研业务费（2021100101）；财政部和农业农村部：国家现代农业（梨）产业技术体系建设项目（CARS-28-04）；河北省农林科学院科技创新专项（2022KJCXZX-SGS-5）。王晋 E-mail：；王迎涛、王永博为通信作者，E-mail：、。DOI：10.16626/ki.issn1000-8047.2023.02.012冀中南地区黄冠梨黑斑病病原菌鉴定*王晋，王亚茹，王红宝，李晓，李勇，王迎涛，王永博（河北省农林科学院石家庄果树研究所，050061）摘
2、要为明确黄冠梨黑斑病的病原种类，采用组织分离法对 100 片病叶、20 个病果进行病原菌分离纯化，基于TEF、ITS、GPD和Alta1序列构建多基因联合系统发育树，并结合形态学特征及致病性测定来确定黄冠梨黑斑病的病原种类及分类地位。试验共得到 62 个链格孢属菌株，选取 6 个代表性菌株进行分类鉴定，其中 HG3-1、HG5、GL1、GG12 和 GL14 与Alternaria alternata聚为一簇，HG2 与A.tenuissima聚为一簇。分离菌株 HG3-1、HG5、GL1、GG12 和 GL14 的分生孢子链为 110 个分生孢子，有分支；HG2 的分生孢子链为 114 个分
3、生孢子，有分支。6 个代表性菌株接种离体叶片和果实后均可发病。确定引起黄冠梨黑斑病的病原菌为A.alternata和A.tenuissima，首次从黄冠梨黑斑病中分离出A.tenuissima。关键词梨黑斑病；链格孢；多基因联合系统发育分析中图分类号：S436.6文献标志码：A文章编号：1000-8047(2023)02-0068-06I Id de en nt ti if fi ic ca at ti io on n o of f t th he e p pa at th ho og ge en ns s c ca au us si in ng g H Hu ua an ng gg gu u
4、a an n p pe ea ar r b bl la ac ck k s sp po ot td di is se ea as se e i in n c ce en nt tr ra al l a an nd d s so ou ut th he er rn n H He eb be ei iWANG Jin,WANG Yaru,WANG Hongbao,LI Xiao,LI Yong,WANG Yingtao,WANG Yongbo(Shijiazhuang Institute of Pomology,Hebei Academy of Agriculture and Forestry S
5、ciences,050061)A Ab bs st tr ra ac ct tIn order to clarify the pathogenic species of Huangguan pear black spot,100 diseased leaves and 20diseased fruits were isolated and purified by tissue isolation method.A polygenic joint phylogenetic tree was constructedbased onTEF,ITS,GPDandAlta1sequences,and t
6、he pathogenic species and classification status of Huangguan pearblack spot were determined by combining morphological characteristics and pathogenicity determination.A total of 62 strainsofAlternariaspecies were obtained,and 6 representative strains were selected for taxonomic identification,among
7、whichHG3-1,HG5,GL1,GG12 and GL14 were clustered withAlternaria alternataand HG2 clustered withA.tenuissima.Theisolated strains HG3-1,HG5,GL1,GG12 and GL14 have 110 conidia in the conidia chain and have branches;the conidiachain of HG2 is composed of 114 conidia with branches.All 6 representative str
8、ains could get sick after inoculating leavesand fruits in vitro.The pathogen causing Huangguan pear black spot was identified asA.alternataandA.tenuissima,firstisolatedA.tenuissima。K Ke ey y w wo or rd ds spear black spot;Alternaria alternata;multi-gene phylogenetic analysis黄冠梨是我国华北地区梨主栽品种，以早熟、高抗黑星病
9、、优质等特点在国内市场以及国际出口贸易中占有很大竞争优势1。近年来，梨黑斑病已成为黄冠梨产区的重要病害之一，不仅引起梨树早期落叶，而且危害贮藏期梨果，严重时造成大量果实腐烂，造成巨大的经济损失，制约了梨产业的绿色健康发展2-3。国内有关梨黑斑病病原菌鉴定的报道中，杨晓平4通过对湖北省砂梨主产区梨黑斑病的分离鉴定，确定侵染黄花梨、翠玉等砂梨的优势菌株为Alternaria alternata（链格孢）。向均5对来源于我国南方 9 个省份的 234 个菌株进行鉴定，鉴定出A.gaisen（梨黑斑链格孢）、A.tenuissima（细极链格孢）、A.longipes（长柄链格孢）、A.spp、A.d
10、umosa（云南铁杉链格孢）、A.citrimacularis（橘斑链格孢）、A.malvae（锦葵链格孢）及A.herbiphorbicola69王晋，王亚茹，王红宝，等：冀中南地区黄冠梨黑斑病病原菌鉴定8 种链格孢属真菌。王文青等6从来源于我国 14 个梨主产区的 405 个链格孢属菌株中鉴定出A.tenuissima、A.alternata、A.gaisen、A.longipes、A.arborescens（乔木链格孢）和A.gossypina（棉链格孢）6 种链格孢属真菌。综合比较分析发现，世界各国报道可侵染梨的链格孢有 9 种7，其中我国发现 8 种5。我国地理跨度大，且栽培梨品种丰
11、富多样，不同地理来源的链格孢属菌株的致病性和寄生专化性均存在明显差异6。前期研究鉴定了多个南方梨产区的梨黑斑病菌种，但有关北方黄冠梨黑斑病病原菌种的鉴定研究相对匮乏。因此，开展河北省黄冠梨黑斑病的病原菌种鉴定将揭示侵染黄冠梨的优势种。由于链格孢属真菌形态特征相似且易随环境变化，基于TEF（翻译延长因子）、ITS（转录间隔区）、GPD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因）、Alta1（过敏原基因）等单基因序列比对分析构建系统发育树，已成为分类鉴定的重要依据8-11。然而，对同一个菌株进行种类鉴定时，单基因构建的系统发育树结果往往不一致。因此，进行多基因联合系统发育分析，能够克服不同基因间进化速率差异和单
12、基因横向基因转移对进化分析的影响，从而提高鉴定准确性12。本研究以TEF、ITS、GPD和Alta1四基因联合构建系统发育树，并结合形态学特征及致病性测定，对河北省黄冠梨黑斑病病原菌种类进行鉴定。为有针对性地选择防治药剂，有效防治黄冠梨黑斑病提供参考依据，为了解黄冠梨黑斑病病原菌的种类多样性提供新的信息。此外，由于链格孢菌产生毒性次级代谢物，正确鉴定黄冠梨黑斑病病原菌种类对评估与梨相关的链格孢菌种所造成的毒性风险也至关重要。1材料与方法1.1病原菌分离纯化黄冠梨黑斑病叶片来源于河北省农林科学院石家庄果树研究所黄冠梨园，共采集 3 批，共 100片病叶；病果来源于河北省晋州市梨产区冷库，随机选取
13、 20 个病果。通过常规组织分离方法，对具有典型症状的黑斑病叶片和病果进行分离。具体操作方法：用剪刀剪取病健交界处的叶片、果实，用75%酒精浸泡 30 s，无菌水清洗 3 次，晾干后置于PDA 培养基（索莱宝生物科技有限公司生产）中。平板置于 26 恒温培养箱中，黑暗条件培养。23 d 后，使用接种针挑取菌落边缘单根菌丝转入新的 PDA 培养基进行纯化培养。取菌丝块于 10%甘油冷藏管中 4 长期保存。1.2病原菌分子生物学鉴定PDA 液体培养基培养代表菌株 7 d，过滤、收集菌丝和分生孢子。经液氮研磨成粉末后，利用真菌菌丝 DNA 快速抽提试剂盒（Omega Bio-tek 公司）提取菌株基
14、因组 DNA。真菌保守基因通用引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司北京分公司合成。表 1试验引物序列引物引物序列（5-3）基因参考文献ITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGGITS13ITS4TCCTCCGCTTATTGATATGCGPD-1CAACGGCTTCGGTCGCATTGGPD11GPD-2GCCAAGCAGTTGGTTGTGCTEF1-728FCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTEF14TEF1-986RTACTTGAAGGAACCCTTACCAlta1FATGCAGTTCACCACCATCGCAlta115Alta1RACGAGGGTGATGTAGGCGTC
15、PCR 反应体系为 50 L，2Es Taq MasterMix（南京诺唯赞生物科技有限公司）25 L，菌株总DNA 模板 2 L，上下游引物各 2 L（10 mol/L），ddH2O 19 L。ITS1/ITS4 和 TEF1-728F/TEF1-986R扩增程序：94 预变性 5 min，94 变性 30 s，52 退火 30 s，72 延伸 45 s，30 个循环，最后72 延伸 10 min；GPD-1/GPD-2 扩增程序：94 预变性5 min，94 变性30 s，56 退火30 s，72 延伸 45 s，30 个循环，最后 72 延伸 10 min；Alta1F/Alta1R 扩
16、增程序：94 预变性 5 min，94 变性 30 s，58 退火 30 s，72 延伸 45 s，30 个循环，最后 72 延伸 10 min。PCR 扩增产物送交测序公司进行双向测序。测序结果拼接后，与 GenBank 中的链格孢属及相近种的序列进行同源性比对分析。将同一菌株的 4 个基因TEF、ITS、GPD、Alta1进行拼接，利用 MEGA-X软件构建黄冠梨黑斑病病原菌系统进化树，以A.infectoria为外群，TN93G 为最佳模型，Boostrap值 为 1 000，采 用 最 大 似 然 法 ML（MaximumLikelihood）16。分析该菌株与其他菌株的亲缘关系，70王晋，王亚茹，王红宝，等：冀中南地区黄冠梨黑斑病病原菌鉴定以确定其分类地位。1.3病原菌形态学鉴定将代表菌株分别接种于 PCA 培养基（马铃薯20 g，胡萝卜 20 g，琼脂 15 g，蒸馏水 1 000 mL）中，每个平板插入 4 对灭菌的盖玻片。在 26 黑暗条件下培养 58 d。通过光学显微镜观察病原菌分生孢子形状、颜色、大小、膈膜数、喙有无的特征，通过体视镜观察病原菌的产孢表型。1.4病原
