1、2023 年 第 4 卷 第 1 期|Synthetic Biology Journal 2023，4（1）：47-66CRISPR/Cas系统的挖掘、改造与功能拓展柳柯，林桂虹，刘坤，周伟，王风清，魏东芝（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，鲁华生物技术研究所，上海 200237）摘要：规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白（CRISPR/Cas）是一种微生物获得性免疫系统，自从证实其可用于基因编辑之后，迅速增强了我们编辑、操纵、注释、检测甚至成像生物体DNA和RNA的能力，为基础生命科学、医学和生物工程等领域的创新发展注入了强劲动力，快速推动了合成生物学等学科的兴盛发展。然而，CRI
2、SPR/Cas系统也有一些固有的问题，例如脱靶效应、原间隔序列邻近基序（PAM）对靶目标的约束性以及基因编辑活性的可控性等，严重制约了该系统在基因精准可控编辑等方面的长足发展，阻碍了其新功能和新应用的拓展。为了突破这些限制，“蛋白质工程修饰Cas蛋白”与“基于生物信息学的新型CRISPR/Cas系统的挖掘”就成为完善发展CRISPR/Cas系统以及扩充CRISPR工具箱的两种重要策略。本文主要针对当前应用最为广泛的类CRISPR/Cas系统，重点介绍了CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas13a这三种代表性系统的基本结构和作用机制，及其在结构改造和功能拓展等方
3、面的新进展，同时也对一些新近发掘的具有重要特色和潜在应用价值的CRISPR/Cas系统进行了综述，例如CRISPR/Cas 和 CRISPR/Cas12k。这些改造和发掘工作显著改善了CRISPR/Cas系统的固有问题，有力地拓展了其功能和适用性，势必会进一步快速推动CRISPR/Cas系统在诸多领域的创新发展。关键词：CRISPR/Cas；基因编辑；脱靶效应；PAM约束；Cas工程改造中图分类号：Q816 文献标志码：A Mining,engineering and functional expansion of CRISPR/Cas systemsLIU Ke，LIN Guihong，LI
4、U Kun，ZHOU Wei，WANG Fengqing，WEI Dongzhi（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，Newworld Institute of Biotechnology，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China）Abstract:The clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)and CRISPR-associated protei
5、ns(Cas)were derived from an acquired immune system in microbes.Since their functions on gene editing have been reported,they have been rapidly used to enhance our ability to edit,regulate,annotate,detect,and image DNA and RNA fragments of various organisms,which consequently have faciliated fundamen
6、tal research in life science,收稿日期：2021-02-08 修回日期：2021-04-28基金项目：国家自然科学基金（21978084）引用本文：柳柯，林桂虹，刘坤，周伟，王风清，魏东芝.CRISPR/Cas系统的挖掘、改造与功能拓展 J.合成生物学，2023，4（1）：47-66Citation：LIU Ke，LIN Guihong，LIU Kun，ZHOU Wei，WANG Fengqing，WEI Dongzhi.Mining，engineering and functional expansion of CRISPR/Cas systemsJ.Synthe
7、tic Biology Journal，2023，4（1）：47-66DOI:10.12211/2096-8280.2021-022特约评述合成生物学 第 4 卷medicine,bioengineering and so on,and drived the development of synthetic biology and other disciplines.However,CRISPR/Cas systems also have some inherent drawbacks,such as off-target effect,constraint of protospacer-ad
8、jacent motif(PAM)on the target,and controllability of the gene editing activity,which substantially compromise their applications in highly precise and controllable gene editing.In order to overcome these challenges,two important strategies have been employed to develop enhanced CRISPR/Cas systems a
9、nd expand the CRISPR toolbox,including modifying the Cas proteins by protein engineering and mining novel CRISPR/Cas systems with bioinformatics.In the review,focusing on the most widely used the type II CRISPR/Cas systems,we mainly introduce the basic structures and functions of three representativ
10、e systems,including CRISPR/Cas9,CRISPR/Cas12a and CRISPR/Cas13a,as well as recent progress in their structural modifications and functional expansion.Thereinto,engineering strategies for CRISPR/Cas systems have been systematically commented,which include modification methods for Cas proteins and the
11、 way to expand the function of CRISPR/Cas systems by coupling specfic proteins with Cas.In addition,we also review some novel CRISPR/Cas systems with important characteristics and potential applications that have been discovered in recently years,such as CRISPR/Cas and CRISPR/Cas12k.These engineerin
12、g modifications and mining work have greatly addressed the inherent problems of the CRISPR/Cas systems,and effectively expanded their functions and applicability,which will further promote the applications of the CRISPR/Cas systems in many fields.Keywords:CRISPR/Cas;gene editing;off-target effect;PA
13、M constraints;Cas engineeringCRISPR/Cas是一种协助细菌和古生菌抵御外来遗传元件入侵的适应性免疫系统，包含两个主要部分：由重复序列和间隔序列规律成簇排列形成的CRISPR阵列和一系列CRISPR相关蛋白1-3。在生理上，这种微生物免疫系统发挥功能一般包括3个阶段：第一阶段，又称适应阶段，由Cas蛋白复合物（通常为CRISPR适应模块所编码的Cas蛋白）锚定入侵遗传物质，随后切离一部分称为前间隔序列（protospacer）的特定 DNA 序列，并将其插入到两个重复序列之间，作为特定的间隔序列；第二阶段，或称表达及加工阶段，由CRISPR阵列转录为前体 CRI
14、SPR RNA（简称 pre-crRNA），随后由不同的Cas蛋白复合物（有时需要额外蛋白以及RNA分子的协助）加工成为成熟048第 4 卷 的 CRISPR RNAs（简称为 crRNAs）；第三阶段，或称为干扰阶段，加工成熟的crRNAs与Cas蛋白复 合 物 结 合 并 特 异 性 靶 向 切 割 目 标 DNA 或RNA4-7。正 是 基 于 这 种 独 特 的 功 能 机 制，CRISPR/Cas系统迅速发展成为了新一代基因编辑工具，由于其易于设计、成本低廉、编辑效率高等优势，该工具一经出现就快速取代了锌指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFN）8、转录激活样因子
15、效应物核酸酶（transcription activator-like effectors nuclease，TALEN）等传统基因编辑工具9，形成了功能更为强大的基因编辑技术，并广泛应用于基因调控10-12、表观修饰13-15、碱基编辑16-17、基因成像18-20等不同领域，且在微生物、植物、动物甚至人体内表现出了广泛的适用性21-25，强有力地推动了基础生命科学、医学和生物工程等学科的快速发展，尤其是为合成生物学的突破式发展提供了重要技术支撑。鉴于CRISPR/Cas系统对科学与社会重要而深远的影响，其奠基人 Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier因
16、此斩获了2020年度的诺贝尔化学奖26。CRISPR/Cas系统的成功应用，激发了人们对其更多的期待，因此CRISPR/Cas系统被不断地应用于疾病特异性检测、基因治疗和细胞功能精准调控等新领域。尽管相关工作已经取得了令世人瞩目的成就，然而CRISPR/Cas系统固有的脱靶效应、PAM对可编辑基因的限定性和基因编辑活性的可控性等问题，严重影响了CRISPR/Cas系统在应用过程中的精准性、灵活性、可控性和安全性，阻碍了其功能和应用范围的进一步拓展27-31。为了解决这些难题，优化改造现有CRISPR/Cas系统和发掘具有新颖功能特色的CRISPR/Cas新系统，就成为近些年来获得性能更优、用途更广的基因编辑系统的重要策略。目前针对CRISPR/Cas系统常见的优化改造工作有：对向导RNA（guide RNA，gRNA）的优化设计32-33，对Cas蛋白与向导RNA浓 度 的 优 化34-36，对 Cas 蛋 白 的 工 程 化 改造30-31，35，37-45等；而对于 CRISPR/Cas 新系统发掘，近几年也有许多重要的进展，发现了多种极具特色的新式CRISPR/Cas系统，包括C
