1、 基金项目：辽宁省教育厅自然科学基金委员会重点项目，项目编号：。作者简介：田晋明（），男，重庆人，在读硕士研究生，主要研究方向为干细胞与糖尿病的治疗。通讯作者：杨静娴（），女，辽宁大连人，教授，博士学位，主要研究方向为干细胞与组织再生技术。联合 移植对糖尿病小鼠的治疗作用与保护胰岛的机制研究田晋明，赵宇萌，李贺，田雨，杨静娴（辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连）摘要：目的 探究黄连素（，）联合脂肪间充质干细胞（，）对糖尿病（，）小鼠的治疗效果以及对胰岛细胞的保护作用与机制。方法通过一次性腹腔注射链脲佐菌素（）建立 小鼠模型。将成模的小鼠随机分为模型组、组、组、联合组（联合），另取正常小鼠做对照组
2、，每组 只，相应治疗 。观察血糖和糖耐量的变化，并计算糖耐量曲线下面积（，）；酶联免疫吸附实验（，）检测小鼠血清内肿瘤坏死因子（，）、干扰素（，）的水平；苏木精伊红（，）染色检测小鼠胰岛的病理损伤情况；免疫荧光法检测小鼠胰岛 细胞凋亡；免疫组化以及 法检测小鼠胰腺组织 样受体 （，）、髓样分化初反应蛋白 （，）、核因子 （，）、蛋白与 的表达。结果与模型组、组或 组比较，联合组小鼠血糖及糖耐量降低，血清、含量减少，胰岛病理损伤减轻，细胞凋亡数减少，胰腺组织、蛋白与 的表达降低。结论 与 移植联合治疗可通过抑制 信号通路减轻 小鼠机体炎症反应与胰岛的病理损伤，对 小鼠有一定治疗作用，且其效果好于
3、单用 或 治疗。关键词：脂肪间充质干细胞；糖尿病；黄连素；胰岛中图分类号：文献标志码：文章编号：（），（，）：（）（）（）（），（），（）；（）（）（）；（）；，锦州医科大学学报 （）DOI:10.13847/ki.lnmu.2023.01.022 ：；糖尿病（）是一种以高血糖为主要症状的免疫和代谢性疾病，常见类型为 型糖尿病（，）、型糖尿病（，）。胰岛细胞的自身免疫性炎症是两种类型 的重要病理生理机制之一，胰岛的长期炎症诱导胰岛 细胞损伤，将加重 的进程。样受体 （），髓样分化初反应蛋白 （）、核因子 （）是经典的促炎通路，多项研究表明，在 的发生发展过程中，该通路中的相关蛋白表达增加，在体
4、内 和配体结合能引起、的级联反应，从而促使炎症因子表达与释放，引起并加重胰岛 细胞损伤。间 充 质 干 细 胞（，）有强大的免疫调节功能，其能通过旁分泌免疫调节因子起到减轻炎症，促进组织修复的作用，有从根源治疗 的潜力。但多项研究表明，输注治疗 的疗效受患者体内的高血糖、炎症等不良微环境影响。因此改善 患者体内的不良微环境是提高 移植治疗效果的有效途径。黄连素（）产自于黄连，是黄连发挥降血糖效果的主要药效成分，同样能减少 患者机体炎症因子与终末糖基化产物的生成，改善胰岛素抵抗和内质网应激，具有抗氧化、降血糖、保护胰岛 细胞的作用。此外已有研究报道 有促进 分泌营养因子、抑制 凋亡的效果，对 存
5、活有积极作用。我们推测将 与 联合使用可能会提高 对 的治疗效果。因此本研究采用 联合 移植治疗，通过对 小鼠的血糖、糖耐量检测，观察两者联用对 的治疗效果，利用、病理染色、等方法探讨联合治疗对 小鼠胰岛细胞的保护作用及可能机制，阐明 对 的增效作用。材 料 实验动物 级昆明种雄性小鼠，体质量（），购自辽宁长生生物科技有限公司；许可证号：（）。饲养于指定的动物护理室，温度：（）；湿度：（），自由饮食饮水。小鼠适应性饲养 后用于实验。本研究经辽宁中医药大学动物伦理委员会批准后进行，许可证号：（）。主要试剂小鼠脂肪间充质干细胞（）（赛业生物科技有限公司，批号：），链脲佐菌素（，）（北京索莱宝科技有
6、限公司，批号：），培养基（，批号：），胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，批号：），盐酸小檗碱（）（上海麦克林生化科技有限公司，批号：），、酶联免疫试剂盒（上海 科 兴 生 物 科 技 有 限 公 司，批 号 分 别 为：、），染色试剂盒，一抗（上海碧云天生物技术有限公司，批号分别为：、），、兔抗小鼠一抗，标记的抗兔、标记的兔抗小鼠二抗（沈阳 万 类 生 物 技 术 有 限 公 司，批 号 分 别 为：、），羊抗兔（）二抗、显色试剂盒（北京索莱宝生物技术有限 公 司，批 号 分 别 为：，），（公司，批号：），合成试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：），（上海碧云天生物技术有限公司，
7、批号：）。主要仪器培养箱（北京东联哈尔仪器制造有限公司，中国，型号 型），恒温冷冻切片机（赛 默 飞 世 尔 科 技 有 限 公 司，美 国，型 号：型），荧光显微镜（尼康公司，日本，型号：型），血糖仪（三诺生物传感股份有限公司，型号：型），酶标仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，型号：型），实时定量 仪（美国 公司，型号：型）。方 法 造模、分组与给药小鼠适应性喂养 后。禁食不禁水 ，一次性腹腔注射 （）溶液构建 模锦州医科大学学报 年 月，（）型，造模 后恢复进食。于造模后第、第 天行剪尾采血检测血糖。连续两次随机血糖 ，确定为 模型。将成模的 只 小鼠随机分为模型组、组、组、联合组，每
8、组 只，另取 只正常小鼠作为对照组。自成模日开始，组以及联合组，灌胃给予 的，每日 次，连续 ，对照组、模型组、组分别灌胃给予等体积生理盐水；初次灌胃给药次日，组、联合组尾静脉注射 总量为 个小鼠 悬液，对照组、模型组、组小鼠尾静脉注射等量的。小鼠的血糖和糖耐量检测从给予 当天开始，测定给药后第、第、第、第 天小鼠随机血糖，于第 天禁食 后进行空腹糖耐量测试，即灌胃给予小鼠葡萄糖 ，测量、血糖值，并计算曲线下面积（，）。法检测 小鼠血清炎症因子的含量实验结束后对小鼠行眼眶取血，离心 获取血清，采用 试剂盒测定血清 和 的含量，具体操作步骤依照试剂盒说明书进行。小鼠胰腺组织切片病理学分析采血后处
9、死小鼠，取出胰腺组织，多聚甲醛固定，蔗糖脱水，包埋，进行冰冻切片。染色，观察小鼠胰腺组织病理损伤情况；免疫荧光（抗 和抗 ）染色，复染，计算 面积与 细胞数；免疫组织化学（抗、）染色，苏木素复染，计算胰岛平均光密度值（胰岛的光密度值累加起来得到的 值与胰岛的面积 的比值）。以上实验分别保持相同条件拍照，所得图片采用 软件分析。实时荧光 检测小鼠胰腺组织、的表达给药结束后，收集各组小鼠胰腺组织，加入 试剂提取总，检测完 浓度和完整性后按试剂盒说明逆转录成，反应条件为：，个循环。内参基因选用，使用 法计算基因的相对表达量，见表。表 引物序列基因名上游引物序列（）下游引物序列（）统计学方法实验数据以
10、表示，结果采用 软件进行统计分析，血糖、糖耐量数据多组间不同时间点比较采用重复测量双因素方差分析（）结合 检验，其他数据多组间比较采用单因素方差分析（），以 为差异具有统计学意义。结 果 小鼠血糖给予 联合 治疗后，于第、第、第、第 天检测小鼠随机血糖，结果发现，随着病程延长，模型组小鼠血糖持续升高，与对照组比较有显著差异（）；与模型组比较，组、组、联合组小鼠血糖明显降低（），其中 组、组小鼠血糖在第 天后又逐渐回升；而联合组小鼠血糖持续下降，与 组或 组比较有显著差异（），见表。提示 联合 治疗能降低 小鼠血糖，提高 的降血糖效果。小鼠糖耐量经过治疗后，对小鼠进行空腹糖耐量测试。结果显示，模
11、型组小鼠在灌胃葡萄糖溶液 后的血糖及 较对照组明显升高（）；经治疗后，与模型组比较，组、组、联合组小鼠在灌胃葡萄糖溶液 后的血糖及 均出现明显下降（或 ）；其中联合组小鼠灌胃葡萄糖溶液 后的血糖及 降低更显田晋明，等：联合 移植对糖尿病小鼠的治疗作用与保护胰岛的机制研究著，后血糖接近测试前水平，与 组或 组比较有显著性差异（或 ），见表。提示 联合 治疗能增强 改善 小鼠糖耐量的能力。表 联合治疗对 小鼠血糖的影响（，）组别血糖浓度（）初始第 天第 天第 天第 天对照组 模型组 组 组 联合组 注：与对照组比较，；与模型组比较，；与 比较，；与 组比较，表 联合治疗对 小鼠糖耐量的影响（，）组
12、别血糖浓度（）曲线下面积（）对照组 模型组 组 组 联合组 注：与对照组比较，；与模型组比较，；与 组比较，；与 组比较，小鼠血清炎症因子治疗结束后，通过 实验检测 小鼠血清 与 含量发现，与对照组比较，模型组小鼠血清 与 含量明显上升（）；而与模型组比较，组、组、联合组小鼠血清 与 含量明显降低（）；其中联合组小鼠血清 与 含量降低更突出，与 组或 组比较有显著性差异（），见表。提示 联合 治疗能减少 小鼠机体炎症因子的产生，增强 的免疫调节能力。小鼠胰岛病理损伤 染色结果发现，对照组胰岛结构正常，边缘清晰，为圆形细胞团，胰岛内细胞数量较多、排列整齐，胞浆、胞核染色正常；与对照组比较，模型组
13、胰岛边缘模糊不清，普遍萎缩，胰岛内细胞数目减少、排列紊乱，细胞核深染，固缩，胰岛细胞空泡化，且可见明显的炎症细胞浸润；而与模型组比较，组、组、联合组胰岛结构基本正常，边缘清晰，胰岛内细胞数目增多、排列整齐，细胞核、细胞质染色均匀，炎症细胞浸润减少，且联合组小鼠胰岛以上病理损伤现象改善尤其明显，见图。以上结果表明，联合 治疗能减轻 小鼠胰岛的病理损伤。表 联合治疗对 小鼠血清炎症因子的影响（，）组别（）（）对照组 模型组 组 组 联合组 注：与对照组比较，；与模型组比较，；与 组比较，；与 组比较，小鼠胰岛 细胞的凋亡 是主要的细胞凋亡执行者，表达的升高意味着细胞逐渐趋于凋亡，由胰岛 细胞分泌，
14、因此我们利用免疫荧光、染色代表凋亡的胰岛 细胞。结果见图、图，与对照组比较，模型组小鼠胰岛内 面积明显减少（），细胞凋亡数目增多（）；治疗后，与模型组比较，组、组、联合组小鼠胰岛内 面积增多（或 ），凋亡细胞数目减少（或 ）；且与 组或 组比较，联合组小鼠更显著（或 ）。提示锦州医科大学学报 年 月，（）联合 治疗能有效减少 小鼠胰岛 细胞凋亡。图 各组小鼠胰岛的病理损伤改变（染色，）图 各组小鼠胰岛 细胞的凋亡情况（免疫荧光，）与对照组比较，；与模型组比较，；与 组比较，；与 组比较，图 各组小鼠胰岛内 面积（）与 细胞数统计（）小鼠胰岛、蛋白的表达免疫组化结果见图、图，与对照组比较，模型组
15、小鼠胰岛、蛋白的表达明显上升（）；而与模型组比较，组、组、联合组小鼠胰岛、蛋白的表达明显降低（或 ）；其中联合组小鼠降低更明显。表明 联合 治疗能通过抑制 通路相关蛋白及下游炎症因子表达保护胰岛细胞。田晋明，等：联合 移植对糖尿病小鼠的治疗作用与保护胰岛的机制研究图 各组小鼠胰岛、蛋白的表达（免疫组化，）与对照组比较，；与模型组比较，；与 组比较，图 各组小鼠胰岛、平均光密度锦州医科大学学报 年 月，（）小鼠胰腺组织、的表达 小鼠腺组织的 结果见图，与对照组比较，模型组小鼠胰腺组织、表达明显增加（）；治疗后，与模型组比较，组、组、联合组小鼠胰腺组织、表达明显降低（或 ），其中联合组小鼠降低更明
16、显，提 示 联 合 能 通 过 抑 制、表达减少 的胰岛损伤。与对照组比较，；与模型组比较，；与 组比较，；与 组比较，图 各组小鼠胰岛、表达 讨 论 是一种典型的 模型诱导剂，注射 后可引起 细胞内辅酶 （，）的浓度下降，依赖性能量和蛋白质代谢停止，同时诱导一氧化氮（）的合成，导致 细胞死亡，从而引起高血糖，造成机体代谢紊乱。本研究结果发现注射 后，与对照组比较模型组小鼠血糖持续升高，糖耐量受损，胰岛出现病理损伤，细胞凋亡增加，表明本研究采用 构建了可靠的小鼠 模型。与大多数 一样，有治疗 的潜力，但 患者体内微环境的复杂性同样也导致了其疗效的不稳定。目前，增加 移植次数、对 进行基因修饰、与药物联合等方式是研究者们试图增强 移植治疗效果的常用手段。多次注射 能在一定程度上增加其在患者体内发挥治疗作用的有效细胞数量，但也有栓塞的风险，而这是细胞治疗导致患者死亡的原因之一。基因修饰则通过对 过表达负责生存、迁移和免疫调节等特性基因，从而使 的治疗更有针对性，但慢病毒转染后的 的生物安全性与致瘤致畸作用一直是学术界担心的问题。因此运用基因修饰和多次注射的方法提高 治疗效果的实用性还有待考
