1、2023 年 1 月云南化工Jan 2023第 50 卷第 1 期Yunnan Chemical TechnologyVol.50，No.1doi:10.3969/j.issn.1004-275X.2023.01.14枯草芽孢杆菌 HG 02 聚谷氨酸发酵条件优化虎恩熊，贾勇正，钱栋全，李伟建，孙芳芳(云南润杰农业科技股份有限公司，云南昆明650000)摘要:筛选得到了一株高产 聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌 HG 02。通过单因素试验和正交实验对发酵培养基和培养条件进行了优化，小试发酵验证结果显示，优化后 聚谷氨酸的发酵质量浓度达 35.9 g/L。优化后的发酵培养基为:蔗糖 4%，蛋白胨 3.5%
2、，谷氨酸钠 6%，硫酸镁 0.1%，氯化钠 0.5%，氯化钙 0.01%，磷酸氢二钾 0.05%，硫酸锰 0.02%，消泡剂 1%。优化后的培养条件为:初始 pH7.0，装液量 40%，接种量 6%，摇床转速为 220 r/min，37 恒温培养 48 h。关键词:聚谷氨酸;发酵;苦草芽胞杆菌优化中图分类号:TS202文献标识码:A文章编号:1004 275X(2023)01 0050 04Optimization of Fermentation Conditions of Polyglutamic Acid by Bacillus Subtilis HG 02Hu Enxiong，Jia Y
3、ongzheng，Qian Dongquan，Li Weijian，Sun Fangfang(Yunnan unjie Agricultural Technology Co，Ltd，Kunming 650000，China)Abstract:A high yield plant of Bacillus subtilis HG 02 with polyglutamic acid was selected The fermentation medium and conditionswere optimized by single factor experiment and orthogonal e
4、xperiment The optimized fermentation medium is:sucrose 4%，peptone 3.5%，so-dium glutamate 6%，magnesium sulfate 0.1%，sodium chloride 0.5%，calcium chloride 0.01%，potassium hydrogen phosphate 0.05%，manganese sulfate 0.02%，defoamer 1%The optimized culture conditions were as follows:initial pH 7.0，liquid
5、volume 40%，inoculationvolume 6%，shaking table speed 220 r/min，constant temperature incubation at 37 for 48 hKey words:Poly glutamic acid;liquid fermentation;orthogonal test 聚谷氨酸(PGA)是由 D /L 谷氨酸单体通过 酰胺键连接而成的一种直链纤维状生物大分子1，是一种具有生物可降解性、保湿性、高吸水性、成纤维性、生物相容性、可食用性和超强的吸附性等特性的不具毒性的新型天然高分子2，被广泛运用于食品、医药、环保、化妆品和
6、农业等多个领域。目前 聚谷氨酸的生产制备主要采用微生物发酵法，在 聚谷氨酸发酵生产中，细菌中芽孢杆菌属类是应用最多的，其中以枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌为典型代表3。微生物发酵法生产 聚谷氨酸，发酵工艺和生产菌株是主要的影响因素，本文通过对实验室现有产 聚谷氨酸菌株的筛选和发酵条件优化，以期实现 聚谷氨酸高产量和高效率生产。1材料与方法1.1材料与仪器化学试剂:蔗糖、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、柠檬酸、甘油、酵母浸粉、谷氨酸钠、硫酸镁、氯化钠、氯化钙、磷酸氢二钾、硫酸锰、消泡剂、95%乙醇(除消泡剂外，其余化学试剂均为分析纯)。仪器:恒温摇床，无菌操作台，灭菌锅，恒温培养箱，电子天平，50 L 发酵
7、罐，紫外分光光度计。1.2培养基与培养条件1.2.1培养基平板培养基:蛋白胨0.8%，牛肉膏0.3%，氯化钠 0.5%，葡萄糖 0.25%，琼脂 1.6%，自然 pH;灭菌条件:121，20 min。种子培养基:葡萄糖 1%，蛋白胨 1%，谷氨酸钠 2%，硫酸镁 0.1%，氯化钠 0.5%，磷酸氢二钾0.05%，pH7.0;灭菌条件:121，20 min。初始发酵培养基:蔗糖 3.5%，蛋白胨 2%，谷氨酸钠 4%，硫酸镁 0.1%，氯化钠 0.5%，氯化钙0.01%，磷酸氢二钾0.05%，硫酸锰0.02%，消泡剂1%，pH7.0;灭菌条件:121，20 min。1.2.2培养方法平板活化培养
8、:在无菌条件下，挑取一环保存于4 冰箱的枯草芽孢杆菌株种接种于平板培养基中，37 恒温培养 12 14 h，作为一次活化菌种。将一次活化菌种接种于新鲜平板培养基中，37 下静置培养 12 14 h，作为二次活化菌种。种子培养:在无菌条件下，挑取平板培养好的二次活化菌种接种于摇瓶种子培养基上，置于摇床上200 r/min，37 恒温培养约 12 14 h，待 OD600大于8 时取出为种子液备用。发酵培养:以 3%的接种量将种子培养液接种到250 mL 三角瓶中，按照发酵液初始 pH7.0，发酵转速200 r/min，发酵温度 37，装液量 60%即 150 mL 进行恒温培养 72 h。1.3
9、高产 聚谷氨酸菌株筛选挑选实验室现有的 8 株产 聚谷氨酸菌株，分别接种于平板培养基活化后，在无菌条件下接种至种子摇瓶上，待 OD600值大于 8 时接种至发酵摇瓶上进052023 年 1 月云南化工Jan 2023第 50 卷第 1 期Yunnan Chemical TechnologyVol.50，No.1行发酵培养，37 恒温培养 72 h 后测定 聚谷氨酸产量，对比得到聚谷氨酸产量最高的菌株 HG 02，其最终产量为 21.3 g/L。菌株 HG 02 经 16 s rDNA鉴定为枯草芽孢杆菌，为谷氨酸依赖性菌株。聚谷氨酸质量浓度采用酒精法测量:取 10 mL 发酵液，10000 r/
10、min 离心30 min，去除菌体。加入3 倍体积的 95%乙醇，充分搅拌待聚谷氨酸析出后，加入蒸馏水进行重溶，再加入 3 倍体积的 95%乙醇析出聚谷氨酸，反复溶 3 次后，将聚谷氨酸置于 50 烘干至恒重，得到聚谷氨酸质量浓度。1.4单因素试验优化初始发酵培养基1.4.1氮源种类与质量浓度筛选以初始发酵培养基为基础，分别设置不同的氮源:牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉，其它条件相同，通过发酵培养测定聚谷氨酸质量浓度获得最佳氮源。再设置最佳氮源的添加量分别为 30 g/L，35 g/L，40 g/L，45 g/L，50 g/L。每个试验组设置 3 个平行，37 恒温培养72 h 后，测定发酵液中聚谷
11、氨酸质量浓度。1.4.2碳源种类与质量浓度筛选以初始发酵培养基为基础，分别设置不同的碳源:蔗糖、葡萄糖、柠檬酸，其它条件相同，通过发酵培养测定聚谷氨酸质量浓度获得最佳碳源。再设置最佳碳源的质量浓度分别为 20 g/L，25 g/L，30 g/L，40 g/L，45 g/L。每个试验组设置 3 个平行，37 恒温培养 72 h 后，测定发酵液中聚谷氨酸质量浓度。1.4.3谷氨酸钠添加量筛选对于谷氨酸依赖型菌株，发酵培养基中必须有谷氨酸存在才能合成聚谷氨酸，如果培养基中没有谷氨酸，则不能合成聚谷氨酸 4。谷氨酸钠的质量浓度就显得非常重要，设置质量浓度分别为 30 g/L，40 g/L，50 g/L
12、，60 g/L，70 g/L。每个试验组设置 3 个平行，37 恒温培养72 h 后，测定发酵液中聚谷氨酸质量浓度。1.5单因素试验优化发酵工艺1.5.1摇瓶转速筛选发酵培养基的转速影响发酵体系的物质传递、氧气传递5。为探寻发酵中最佳摇瓶转速，分别设置转速 为 160 r/min，180 r/min，200 r/min，220 r/min，240 r/min。每个试验组设置 3 个平行，37 恒温培养 72 h 后，测定发酵液中聚谷氨酸质量浓度。1.5.2接种量筛选接种量影响发酵液中菌体的富集速度和含量，从而影响产物的积累。为探寻发酵中最佳接种量，分别设置接种量为 3%，4%，5%，6%，7%
13、。每个试验组设置 3 个平行，37 恒温培养 72 h 后，测定发酵液中聚谷氨酸质量浓度。1.5.3初始 pH 值筛选pH 对微生物的生长和代谢产物生成都有很大影响，不同的微生物对 pH 值的要求是不同的，为探寻发酵中最佳初始 pH 值，分别设置初始 pH 值为6.4，6.6，6.8，7.0，7.2。每个试验组设置 3 个平行，37 恒温培养72 h 后，测定发酵液中聚谷氨酸质量浓度产量。1.5.4发酵温度筛选从酶反应动力学来看，温度升高，反应速度加大，生长代谢加快，产物生成提前。但是，温度越高酶失活越快，菌体易于衰老，影响产物的生成。为探寻发酵过程中的最佳温度，分别设置发酵温度为 32，34
14、，36，38，40。每个试验组设置 3 个平行，37 恒温培养72 h 后，测定发酵液中聚谷氨酸质量浓度。1.5.5发酵时间筛选发酵时间的长短直接关系到产物的积累，为探寻最佳发酵时间，分别设置发酵时间为 24 h，36 h，48 h，60 h，72 h。每个试验组设置 3 个平行，37 恒温培养 72 h 后，测定发酵液中聚谷氨酸质量浓度。1.5.6装液量筛选装液量影响发酵液的溶氧，为探寻最佳发酵装液量，分别设置装液量为 20%，30%，40%，50%，60%。每个试验组设置 3 个平行，37 恒温培养72 h 后，测定发酵液中聚谷氨酸质量浓度。1.6正交试验优化发酵条件根据单因素实验情况，选
15、择培养基及含量、发酵温度、初始发酵 pH、接种量、装液量等来确定最优的发酵条件。正交试验表根据实际情况选择，每组试验设置 3 个平行，通过测定最终 聚谷氨酸质量浓度确定最佳发酵条件。1.7小试发酵根据单因素试验和正交试验结果进行 50 L 罐子小试发酵试验，验证优化后的发酵条件。种子液接种方法为火焰接种法，从发酵开始每隔 2 h 记录 pH 和溶氧的变化，同时发酵 12 h 后每隔 2 h 取样测量 聚谷氨酸质量浓度直至发酵结束。2结果与讨论2.1单因素试验优化培养基成分采用 250 mL 三角瓶进行单因素优化发酵试验，按照发酵初始 pH7.0，发酵转速 200 r/min，发酵温度37，装液
16、量 150 mL，接种量 4%进行培养，发酵时间 48 h，发酵完成后检测发酵终点发酵液中的 聚谷氨酸质量浓度，按 聚谷氨酸质量浓度来确定培养基最优成分及用量。发酵试验结果如图 1，图 2，图 3，图 4，图 5 所示。图 1不同氮源对 聚谷氨酸质量浓度的影响152023 年 1 月云南化工Jan 2023第 50 卷第 1 期Yunnan Chemical TechnologyVol.50，No.1图 2不同碳源对 聚谷氨酸质量浓度的影响图 3蔗糖含量对 聚谷氨酸质量浓度的影响图 4蛋白胨含量对 聚谷氨酸质量浓度的影响图 5谷氨酸钠含量对 聚谷氨酸质量浓度的影响由图可知，菌株 HG 02 发酵生产 聚谷氨酸的最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为蛋白胨，其中蔗糖最佳质 量 浓 度 为 40 g/L，蛋 白 胨 最 佳 质 量 浓 度 为35 g/L，谷氨酸钠最佳质量浓度为 50 g/L。2.2单因素试验优化发酵工艺采用 250 mL 三角瓶进行单因素优化发酵试验，按照单因素优化的培养基配方蔗糖 4%，蛋白胨 4%，谷氨酸钠 5%，硫酸镁 0.1%，氯化钠 0.5%，氯化钙0.01%，磷酸氢二钾0
