1、东南大学学报（医学版）（），；（）：收稿日期 修回日期 基金项目 陕西省重点研发计划项目（）作者简介 庞琳烜（），女，陕西西安人，主治医师。：引文格式 庞琳烜，杨西超，李治琴，等 类风湿关节炎患者血浆 表达及基因高甲基化与疾病活动程度的关系 东南大学学报（医学版），（）：论著 类风湿关节炎患者血浆 表达及基因高甲基化与疾病活动程度的关系庞琳烜，杨西超，李治琴，杜望磊（空军军医大学第一附属医院 临床免疫科，陕西 西安）摘要 目的：探讨类风湿关节炎（）患者血浆微小（）表达及基因高甲基化与疾病活动程度的关系。方法：年 月至 年 月在我院临床免疫科招募 例 患者为 组，基于血细胞沉降率（）获得 个关节
2、疾病活动评分（）测量疾病活动性；另纳入同期健康志愿者 例为对照组。采用实时荧光定量 法检测血浆 水平，实时荧光定量甲基化特异性（）分析甲基化状态。结果：组患者血浆 水平显著高于对照组，基因甲基化水平显著低于对照组（）。血浆 水平与 基因甲基化水平呈负相关（）。随疾病活动程度的增加，患者血浆 水平呈升高趋势，基因甲基化水平呈下降趋势（）。血浆 水平与 评分、反应蛋白水平、关节肿胀计数、关节压痛计数、患者主观总体评估、医生总体评估、简化疾病活动指数呈正相关（）；基因甲基化水平与上述指标呈负相关（）。结论：血浆 及基因甲基化状态与 患者疾病活动程度有关，有望作为诊断和控制 疾病活动的潜在标志物。关键
3、词 类风湿关节炎；微小；甲基化；疾病活动程度中图分类号 文献标志码 文章编号（）：，（，）：（），（）：，（）（），（）：，（）（），（），（）（）：；类风湿关节炎（，）是一种慢性系统性、多因素和进行性自身免疫性疾病。表观遗传学机制的认识为理解 的发病机制带来了新的方向。近年来，微小（，）已成为研究热点，例如 被认为是先天性和适应性免疫细胞分化和功能的重要调节因子。有研究证实，启动子中 结合位点的高甲基化与骨关节炎软骨细胞和滑膜细胞中 表达下调相关。在目前的文献中，没有关于自身免疫性疾病患者 启动子区域甲基化的报道。本研究旨在评估 患者血浆 表达及基因甲基化水平，并将其与疾病活动性相关联，从而
4、为确定 在控制 患者疾病活动中的临床意义提供依据。对象与方法 研究对象 年 月至 年 月在我院临床免疫科招募 例 患者为 组，男 例，女 例，年龄 岁，中位年龄 岁，病程 个月，患者均符合 年美国风湿病学会 欧洲抗风湿病联盟修订的 诊断和分类标准。所有患者在采集血样之前接受了至少 个月的甲氨蝶呤（）治疗。排除存在任何感染、其他自身免疫性疾病、其他关节疾病或恶性肿瘤等严重疾病的患者。选择同期健康志愿者 例为对照组，男 例，女 例，年龄 岁，中位年龄 岁，年龄和性别均与 组匹配（），均无自身免疫性疾病、免疫缺陷和恶性肿瘤家族史。根据赫尔辛基宣言的原则，所有研究对象均知情同意，我院伦理委员会审查批准
5、了本研究。疾病活动程度评估采用罗氏 型全自动生化分析仪检测红细胞沉降率（）、反应蛋白（）水平。基于 获得 个关节疾病活动评分（）测量疾病活动性。将所有 患者分为缓解组（分）及疾病低活动度组（分 分）、中活动度组（分.分）、高活动度组（分）。使用简化疾病活动性指数（）、健康评估问卷（）、健康评估问卷残疾指数量表（）评价健康状况。另外使用视觉模拟标尺（）评分（）评价患者主观整体评估、医生整体评估。血浆 水平检测在 涂层小瓶中采集血样（），以分离血浆。部分样本用于实验室参数包括、补体 和、类风湿因子（）和抗环瓜氨酸肽（抗）分析。样品离心后储存于 直到分析。另一部分血浆冷冻在含有 的试管（）中直到 表
6、达定量分析。利用 试剂盒（美国）从血浆中分离。提取后采用 扩增试剂盒（美国 ）进行 合成。在最后 体积中进行扩增反应，将三步 的热循环设定在 下 作为保持时间，然后 变性 和 退火 进行 次循环，并在 下延伸。得到 温度下的扩增曲线和循环阈值（）。的表达被用作数据庞琳烜，等 类风湿关节炎患者血浆 表达及基因高甲基化与疾病活动程度的关系标准化的内源性对照，使用 方法计算 相对表达量，组对照组。从 基因组浏览器中获得了（）转录起始位点（）上游启动子的 个碱基对。用 软件扫描上述区域，寻找预测的转录因子结合位点。引物序列如下：正向，反向；：正向，反向。定量甲基化特异（）分析用甲基引物表达软件设计了两
7、对靶向区引物；一个能识别甲基化，另一个能识别非甲基化。在 反应中，用 和 引物（源自 软件）扩增 亚硫酸氢盐处理的基因组。产物使用 纯化试剂盒（美国）清洗，使用实时 仪器（，美国 ）对 基因调控元件的特定区域进行。通过在标准曲线中插入非甲基化引物循环阈值减去甲基化引物循环阈值（）的差值作为，利用 方法来计算 甲基化值。使用甲基化和非甲基化人类对照样品与、及甲基化 的混合物构建计算 甲基化值的标准曲线。引物序列如下：正向，反 向；：正向，反向。统计学处理使用 软件处理数据。二分类变量以率（频率）表示，行卡方检验；偏态分布数据以中位数（四分位值）表示，采用 检验和事后 分析；采用 相关系数法分析相
8、关性，多元线性回归模型分析血浆 及基因甲基化水平与疾病活动指标的关系。双侧 认为差异具有统计学意义。结 果 两组临床资料比较 组患者血浆、水平显著高于对照组，基因甲基化水平显著低于对照组（），见表。表 两组临床资料比较指 标对照组（）组（）或 值 值年龄 岁（，）（，）男性 例 体质指数 （，）（，）（，）（，）（，）（，）表达水平（，）（，）基因甲基化水平（，）（，）血浆 表达与基因甲基化的关系经 秩相关系数分析，患者血浆 水平与 基因甲基化水平呈负相关（.，图）。不同疾病活动程度 患者临床资料比较随疾病活动程度的增加，患者血浆 水平呈升高趋势，基因甲基化水平呈下降趋势（）。疾病高活动度组
9、患者血浆 水平显著高于中活动度组、低活动度组和缓解组（）；高活动度组 基因甲基化水平显著低于低活动度组和缓解组（）。见表。血浆 表达及基因甲基化与 患者其他指标之间的关系 经 秩相关系数分析，血浆 水平与 评分、水平、关节肿胀计数、关节压痛计数、患者主观总体评估、医生总体评估、呈正相关（），基因甲基化水平与 评分、水平、关节肿胀计数、关东南大学学报（医学版）年 月，（）图 血浆 水平与 基因甲基化水平的关系节压痛计数、患者主观总体评估、医生总体评估、呈负相关（），而两者均与病程、评分、评分、滴度、滴度、线分期无关（），见表。多元线性回归分析进一步校正年龄、性别、体质指数、病程、滴度、滴度以及治
10、疗方案等可能的干扰因素后，经多元线性回归分析，血浆 表达与 评分、水平、关节肿胀计数、关节压痛计数、患者主观总体评估、医生总体评估、仍呈正相关（.，表）；同样，血浆 基因甲基化水平与 评分、水平、关节肿胀计数、医生总体评估、仍呈负相关（，表）。表 不同疾病活动程度 患者临床资料比较指 标缓解组（）低活动度组（）中活动度组（）高活动度组（）或 值 值年龄 岁（，）（，）（，）（，）男性 例 体质指数 （，）（，）（，）（，）病程 年（，）（，）（，）（，）（，）（，）（，）（，）水平 （，）（，）（，）（，）滴度 （，）（，）（，）（，）滴度 （，）（，）（，）（，）剂量 （，）（，）（，）（，
11、）生物制剂使用史 例 （除）使用史 例 血浆 表达（，）（，）（，）（，）血浆 基因甲基化（，）（，）（，）（，）与缓解组相比，；与低活动度组相比，；与中活动度组相比，庞琳烜，等 类风湿关节炎患者血浆 表达及基因高甲基化与疾病活动程度的关系表 血浆 表达及基因甲基化与 患者主要临床指标之间的关系指 标血浆 表达血浆 甲基化 值 值 水平 病 程 关节肿胀计数 关节压痛计数 患者主观整体评估 医生整体评估 评分 评分 滴度 滴度 线分期 讨 论 是一种自身免疫性疾病，其特征是滑膜组织的慢性炎症，最终导致不可逆转的关节破坏和终身残疾。表观遗传学在 的发病机制中起重要作用，尤其是 甲基化和非编码。本
12、研究中我们分析了 患者血浆中 表达及甲基化水平是否可能是 患者疾病活动严重程度的潜在标志物。我们证实，组患者血浆 水平显著高于对照组，基因甲基化水平显著低于对照组，且二者与疾病活动程度密切相关，有望成为早期预测和控制 患者疾病活动的有效生物标志物。是一类长度为 个核苷酸的非编码，是调节细胞发育、先天性和获得性免疫反应相关基因表达的主要表观遗传学机制之一，。甲基化导致的 转录沉默已在不同类型的疾病中得到证实，这表明它包括导致异常 表达的机制。本研究中我们证实了 组和对照组之间 甲基化水平的显著差异。我们发现 患者 基因甲基化水平显著降低。这些结果与基因启动子区域的过度甲基化导致其蛋白质合成减少的
13、表 血浆 表达与 患者疾病活动指标的关系变 量偏回归系数标准差回归系数置信区间 值 值 评分 水平 关节肿胀计数 关节压痛计数 患者主观整体评估 医生总体评估 一般表观遗传原理一致。正如预期的那样，我们证实 基因高甲基化水平与较低的 表达相关。在 患者中我们注意到，评分较高的患者有较高的血浆 水平和较低的基因甲基化水平趋势。关于 中 甲基化水平的文献很少，但在其他情况下也发现了类似的结果。例如，在骨关节炎患者的软骨细胞和滑膜细胞中，调节区中特定 位点的超高甲基化与 的下调相关，这可能有助于骨关节炎的进展。在肺癌细胞中，启动子高甲基化导致 表达受到显著抑制。据报道，与炎症控制、滑膜细胞生长及破骨
14、细胞生成密切相关，从而影响 患者的疾病活动性和严重程度。本研究中我们发现，与对照组相比，血浆 水平显著上调，并且血浆 水平与患者疾病活动指标包括 评分、水平、关节肿胀计数、关节压痛计数、患者主观总体评估、医生总体评估呈正相关。其他作东南大学学报（医学版）年 月，（）表 血浆 基因甲基化水平与 患者疾病活动指标的关系变 量偏回归系数标准差回归系数置信区间 值 值 评分 水平 关节肿胀计数 关节压痛计数 患者主观总体评估 医生总体评估 者也发现 患者 表 达 增 加，并 且 与 评分、水平及 呈正相关。以往研究表明，上调的 可通过多种促炎机制促进 的进展，。是调节性 细胞（细胞）的抑制功能和 反应
15、的抑制所必需的，反应是诱导和维持炎症的关键因素，。在许多免疫细胞包括 细胞、细胞、单核细胞、巨噬细胞和产生白细胞介素（）的 细胞中，显著上调，并且发现它与肿瘤坏死因子（）及 水平呈正相关。此外，在 患者的 细胞中 水 平 与 控 制 细 胞 死 亡 的 相 关 因 子（）水平呈负相关，的增加最终导致 细胞凋亡抑制，促进 炎症的发生。表达增加可能通过减少 细胞死亡和诱导、等来促进 炎症反应，。总之，在免疫调节以及 疾病活动中是重要的表观遗传调节因子。综上，随着疾病活动程度的增加，患者血浆 水平升高，基因甲基化水平降低。我们证实血浆 及基因甲基化状态与 患者疾病活动程度有关，可能成为诊断和控制 疾
16、病活动的潜在标志物，并有助于进一步了解 进展机制。但本研究仍有局限性：首先，研究纳入样本量较小，因此需要更多更大的研究来确认；其次，对照组仅限于健康个体，应考虑其他疾病如红斑狼疮、感染、骨关节炎、其他炎症性疾病患者的对照组。此外，及基因甲基化在 发病机制中的作用尚不明确，仍需进一步研究。参考文献 段毅，易谭勇，朱乐全，等 调控 影响类风湿性关节炎滑膜细胞增殖、凋亡和炎性反应 中国组织化学与细胞化学杂志，（）：郭淑芳，姜婷婷 下调 抑制类风湿性关节炎患者外周血单个核细胞炎症反应的实验研究 中国免疫学杂志，（）：，（，）：，（）：朱嘉豪，陈婷，习欠云 参与不同疾病的研究进展 中国生物工程杂志，（）：胡钰镔，陈德丽，施月娟，等 外周血单个核细胞 和微管相关蛋白 轻链 及红细胞沉降率与类风湿关节炎疾病活动的关系 中华实用诊断与治疗杂志，（）：，：，（）：，（）：，：魏亭亭，秦苇，冯伟伟，等 类风湿关节炎患者疲劳程度与疾病 活 动 度 的 关 系 浙 江 医 学，（）：，（）：，庞琳烜，等 类风湿关节炎患者血浆 表达及基因高甲基化与疾病活动程度的关系东南大学学报（医学版）（），；（）：，（）：，
