1、化学与生物工程 ，基金项目：国家重点研究发展计划项目（）收稿日期：作者简介：管圣迪（），女，河北承德人，硕士研究生，研究方向：环境污染微生物修复技术，：；通讯作者：于妍（），女，博士，副教授，研究方向：环境污染微生物修复技术，：。：管圣迪，苏颖轩，李梦莉，等 老化石油污染土壤微生物群落多样性特征 化学与生物工程，（）：，（）：老化石油污染土壤微生物群落多样性特征管圣迪，苏颖轩，李梦莉，罗海梅，于妍（中国矿业大学（北京）化学与环境工程学院，北京 ）摘要：利用 高通量测序技术分析了延长某页岩气井田场地老化石油污染土壤的微生物群落多样性，采用冗余分析探究了微生物群落结构与土壤环境因子的关系。结果表明
2、，石油污染可改变土壤微生物群落结构及多样性，石油污染 土 壤 微 生 物 的 优 势 菌 门 为 变 形 菌 门（）、放 线 菌 门（）；鞘 氨 醇 单 胞 菌 属（）、分枝杆菌属（）、芽孢杆菌属（）、节杆菌属（）、交替红色杆菌属（）和诺卡氏菌属（）等种菌属具有石油烃类污染物降解功能，分枝杆菌属和短波单胞杆菌属（）具有重金属降解功能；影响微生物群落多样性的环境主控因子为 值、石油烃含量和重金属含量，石油烃的摄入会导致土壤中重金属含量升高。关键词：老化土壤；石油污染；微生物群落；多样性；环境主控因子中图分类号：，（，（），）：，：；我国经济高速发展，能源需求迅速增长，能源供需矛盾日益突出，非常规
3、能源越来越受到人们的重视。但是页岩气开采造成土壤中石油含量增加，显著影响微生物群落，导致土壤微生物数量减少及生物多样性管圣迪，等：老化石油污染土壤微生物群落多样性特征 年第期 降低。土壤微生物是土壤的重要组成部分，其种类较多，在土壤的形成发育、物质循环和肥力演变等过程中发挥关键作用。页岩气开采造成的土壤污染具有隐蔽性、滞后性、累积性、不可逆转性等特点。因此，切实有效地解决石油污染土壤的修复问题，成为国内外研究的热点。石油污染土壤的修复技术主要有物理修复、化学修复和生物修复。其中，生物修复技术因具有成本低、几乎不产生二次污染和可进行原位修复等优点而受到广泛关注。延长油气田位于鄂尔多斯盆地，鄂尔多
4、斯盆地延长组长段烃源岩分布广泛，处于生油窗后期 生湿气窗的高峰期，油气共生，部分成熟度较高的区域产气强度较大，具备页岩气成藏的物质基础，因此，页岩气开采发展迅速。但在页岩气开采过程中产生的油基岩屑会污染土壤。年，我国出台了禁止油基岩屑落地的政策，因此后期没有新增石油污染土壤，但是了解石油污染土壤的污染现状对于指导土壤生物修复具有重要意义。基于此，作者采集延长某页岩气井田场地老化石油污染土壤，以周围未受石油污染土壤作为对照，利用 高通量测序技术分析土壤微生物群落多样性，采用冗余分析（）探究微生物群落结构与土壤环境因子的关系，为探究土壤微生物对石油的耐性机制、开发土壤修复技术提供理论支撑。实验土壤
5、样品采集 年 月在陕西省延长某页岩气井田场地按照棋盘布点法设置个点位，每个点位采集 小样方的四角及中心 深的土壤样品，混合得到该点位的土壤样品，依次编号为 ；同时在井田场地外采集未污染土壤样品作为对照，编号为 。所有土壤样品剔除草根和石块后储存于采样袋内，置于装有冰袋的恒温箱中，立即带回实验室保 存，用 于 微 生 物 高 通 量 测 序 的 土 壤 样 品 于 下保存。土壤样品的理化性质分析将采集的土壤样品自然风干，研磨过筛，采用火焰原子吸收分光光度法测定总铬，采用石墨炉原子吸收分光光度法测定铅，采用碳酸氢钠浸提钼锑抗分光光度法测定有效磷，采用重铬酸钾氧化分光光度法测定有机碳，采用凯氏定氮法
6、测定总氮，采用电位法测定 值，采用重量法测定含水率和含盐量，采用气相色谱法测定石油烃。采用 软件对土壤样品的各项理化指标的变化量进行相关性分析。微生物 的提取及高通量测序对土壤样品进行预处理，用 提取试剂盒（，）提 取。对样本进行质检，样本浓度在 之 间。采 用 通 用 引 物 （）、（）对 区 目 的 基 因 进 行 扩增，在第二轮扩增中引入 桥式 兼容引物。最后，在 平台对 的 高变区进行高通量测序。测序数据分析对 测序所得原始数据进行拼接，区分样本后对序列质量进行质控和过滤，然后对所得操作单元（，）进行聚类分析和物种分类学分析。基于聚类分析结果，对进行多种多样性指数分析，计算 多样性指数
7、（指数、指数、指数等），以表征微生物群落多样性，鉴别采样点的石油降解优势菌属。利用语言绘制聚类韦恩图、聚类堆积柱状图，并对优势菌门、菌属的丰度与理化性质进行冗余分析。结果与讨论土壤样品的理化性质（表）表土壤样品的理化性质 土壤样品 值有机碳 总氮 有效磷 总铬 铅 含水率石油烃 含盐量 管圣迪，等：老化石油污染土壤微生物群落多样性特征 年第期 采样点地处西北，干旱少雨，盐碱积累，土壤的 值和含盐量高。由表可知，污染土壤样品的 值范围在 之间，均高于未污染土壤样品；污染土壤样品的有机碳含量在 之间，均高于未污染土壤样品；未污染土壤样品的含盐量较低，远远低于污染土壤样品，但含水率远远高于污染土壤样
8、品，主要是因为石油具有疏水性，石油污染土壤的疏水性也随之升高，导致土壤储水能力下降，含水率除低；污染土壤样品的铅含量在 之间；污染土壤样品的石油烃含量在 之间，均高于未污染土壤样品，其中 样品的石油烃含量最高，是未污染土壤样品的 倍左右。石油烃含量较高的土壤样品（、）的碳氮比失衡，均高于 ，主要是由于陕北地区黄绵土氮含量低，碳含量高，导致碳氮比较高。将污染土壤样品与未污染土壤样品的理化性质进行 相关性分析，结果见表。表土壤理化性质的 相关性分析 指标 值有机碳总氮有效磷总铬铅含水率石油烃含盐量 值 有机碳 总氮 有效磷 总铬 铅 含水率 石油烃 含盐量注：表示在 级别（双尾），相关性极显著；表
9、示在 级别（双尾），相关性显著。由表可知，值与有机碳含量呈极显著负相关性，总氮含量与有效磷含量、铅含量与石油烃含量均呈极显著正相关性，有效磷含量与含水率呈显著正相关性，其它指标间的相关性不显著。微生物群落多样性分析 聚类分析（图）图 聚类韦恩图 由图 可 知，个 土 壤 样 品 共 同 含 有 个。数量顺序为：，其中 样品含有的 数量最多，和 样品含有的数量最少，说明石油污染土壤中微生物数量减少，主要是受石油污染物的胁迫和环境因素的影响。多样性指数分析在 相似度水平下，计算 多样性指数，结果见表。表 多样性指数 土壤样品 指数和 指数反映了微生物群落管圣迪，等：老化石油污染土壤微生物群落多样性
10、特征 年第期 的丰富度和多样性，数值越大说明群落丰富度和多样性越高；指数反映了微生物群落的均匀性，数值越小，说明群落分布越均匀。由表可知，和 样品的 指数和 指数较大，说明微生物群落丰富度和多样性较高；样品的 指数最小，说明未污染土壤样品的微生物群落均匀性高于污染土壤样品。对比发现，石油烃的摄入降低了土壤微生物丰富度，石油烃含量越高，多样性越低，群落分布越不均匀。石油降解微生物优势菌落分析门水平物种相对丰度如图所示。图门水平物种相对丰度聚类堆积柱状图 由图可知，变形菌门（）的相对丰度最高，为优势菌门，广泛存在于石油污染土壤中，说明其对老化石油污染土壤环境具有较强的适应性；放线菌门（）在个样品中
11、同样表现出了丰度优势；此外，酸杆菌门（）、拟杆菌门（）、芽单胞菌门（）在个样品中均有一定丰度。污染土壤样品中，样品与其它样品在门水平上有较大的差异，其余样品微生物组成略有差异，与 样品在门水平上一致。相较于 样品，由于石油烃类污染物的摄入，变形菌门、绿弯菌门（）的相对丰度明显上升，其中石油烃含量较高的 样品中变形菌门微生物的增加尤为明显，而放线菌门的相对丰度有所降低。表明在石油污染土壤的老化过程中，变形菌门微生物增多，而放线菌门微生物减少。当土壤被石油烃污染时，相对丰度显著升高或新出现的细菌可以被视为石油烃降解菌（嗜油性细菌），而相对丰度 显 著 降低 的细菌可以被视 为疏油性细菌。因此推断延
12、长地区嗜油性菌门为变形菌门和绿弯菌门，这与辽河石油污染土壤微生物群落结构多样性的研究 及陕北石油污染土壤微生物多样性的研究 结果一致。将相对丰度前 的物种进行属水平分析，结果如图所示。图属水平物种相对丰度聚类堆积柱状图 由图可知，未污染土壤样品与污染土壤样品中优势菌群组间差异较大。不同采样点属水平上群落结构有差异，其中 与 样品在属水平上相似性最高。根据各样品理化性质，可以看出属水平相似性管圣迪，等：老化石油污染土壤微生物群落多样性特征 年第期 较高的样品，其 值、有机碳含量相似性最高。污染土壤 样 品 中 主 要 菌 属 有 鞘 氨 醇 单 胞 菌 属（）、分枝 杆 菌 属（）、芽孢杆菌属（
13、）、节杆菌属（）、交替红色杆菌属（）、诺卡氏菌属（）。对属水平占比较高的优势菌群进行功能性分析，结果见表。表占比较高的优势菌群的功能性分析 菌属主要功能占比 鞘氨醇单胞菌属（）降解芳香化合物 分枝杆菌属（）降解甾醇侧链 降解有机物 芽孢杆菌属（）降解石油烃 节杆菌属（）高效降解环境中有机污染物 交替红色杆菌属（）降解类固醇激素 诺卡氏菌属（）产表面活性剂，参与石油烃降解 石油烃降解菌能将碳氢化合物转化为能源、生物质及生物废料副产品。石油污染土壤样品中，共有个属具有石油烃类污染物降解功能，其中诺卡氏菌属和芽孢杆菌属可产表面活性剂，降低石油烃类污染物表面张力，实现其乳化和增溶；鞘氨醇单胞菌属含有一
14、组独特的芳香化合物降解基因，可通过调节细胞表面疏水性来适应石油污染环境。假单胞菌属（）、红球菌属（）、微杆菌属（）、芽孢杆菌属、产碱杆菌属等是常见的石油烃降解菌。王耀民 从大港油田长期被原油污染的土壤中分离、筛选出株能以原油为唯一碳源的菌株，其中株原油降解率高的菌株分别为不动杆菌属和芽孢杆菌属。微生物群落结构与土壤环境因子的关系微生物群落结构是土壤微生态环境的响应，要结合理化指标进行分析。对个土壤样品微生物门和属水平与理化性质进行冗余分析，结果如图所示。图微生物门水平（）、属水平（）冗余分析 （）（）管圣迪，等：老化石油污染土壤微生物群落多样性特征 年第期 由图 可知，第一主轴和第二主轴分别解
15、释了总方差变量的 和 ，第一主轴上总氮含量是主要的影响因子，第二主轴上 值和总铬含量是主要的影响因子。其中 值、总氮含量、总铬含量是微生物门水平的主要影响因子，石油烃含量也对微生物门水平有影响，尤其是与变形菌门具有显著的正相关性。土壤中微生物数量最多的变形菌门受 值的影响较大。铅含量与石油烃含量存在显著的相关性，说明石油污染会导致土壤中重金属含量升高，进而加重土壤污染，与 相关性分析（表）结果一致。受石油烃的影响，微生物菌门在结构上会发生变化，其中 与 样品的菌门结构相似性高，其微生物菌门主要受石油烃含量、铅含量、值 的 影 响；样品主要受总氮含量的影响；与 样品的菌门结构相似性较高，与门水平
16、聚类堆积柱状图（图）结果一致。由图 可知，第一主轴和第二主轴分别解释了总方差变量的 和 。第一主轴上 值、铅含量、石油烃含量是主要的影响因子，第二主轴上石油烃含量和总铬含量是主要的影响因子，因此，与微生物群落结构相关性较高的土壤理化指标是石油烃含量、值和重金属含量。、分枝杆菌属与石油烃含量存在显著正相关性，推测其对石油烃具有良好的降解潜能；分枝杆菌属与铅含量具有显著正相关性，其对铅具有良好的降解性能；鞘氨醇单胞菌属与 值具有显著正相关性，与石油烃含量具有正相关性，与荆佳维等 的研究 结 果 一 致。、短 波 单 胞 杆 菌 属（）与总铬含量存在显著正相关性，推测其对总铬有降解能力。、样品的菌属相似性较高，、样品与其它样品不同，未污染土壤与污染土壤样品的菌属差异性大。结论利用 高通量测序技术分析了延长某页岩气井田场地老化石油污染土壤的微生物群落多样性，采用冗余分析探究了微生物群落结构与土壤环境因子的关系，结论如下：（）石油污染土壤偏碱性，土壤污染不均匀，石油烃含量差异较大，由于石油烃污染造成碳氮比失衡，氮含量不足。（）石油污染土壤微生物的优势菌门为变形菌门和放线菌门；鞘氨醇单胞菌属、分枝
