1、西 北 农 业 学 报 ，（）：梨果黑斑病菌钙调磷酸酶基因生物信息学分析及其对侵染结构分化的调控作用收稿日期：修回日期：基金项目：国家自然科学基金（）。第一作者：杨阳阳，女，硕士研究生，研究方向为果蔬采后生物技术。：通信作者：李永才，男，博士，教授，研究方向为果蔬采后生物技术。：杨阳阳，毛仁燕，李永才，毕阳，蒋倩倩，谢鹏东，袁晶（甘肃农业大学 食品科学与工程学院，兰州 ）摘要为揭示梨果黑斑病菌 基因的调控作用，采用 技术克隆 基因，利用在线工具对其基因及其编码蛋白进行生物信息学分析；同时分析其在 侵染结构分化过程中的表达特性；并进一步以钙调磷酸酶专一性抑制剂环孢菌素（）处理研究其对 侵染结构分
2、化和致病性的影响。结果 克隆得到和基因，分别命名为 （）和 （），生物信息学分析表明 和 均无跨膜结构，且具有多个磷酸化位点，主要定位于细胞核上；包括一个 端催化结构域、结合结构域、钙调素 结合结构域和自抑制蛋白结构域，具有个 结合位点。分析表明，在疏水及果蜡诱导 侵染结构分化过程中 和 基因表达量均显著上调，且果蜡诱导作用更明显。药理学表明，环孢菌素处理显著抑制疏水性和蜡质诱导的 孢子萌发和附着胞形成，同时还可抑制损伤接种 早酥梨黑斑病的扩展。综上结果表明 和 参与 侵染结构形成的调控。关键词梨果黑斑病菌；钙调磷酸酶；生物信息学分析；基因表达特性；环孢菌素 梨果黑斑病菌互隔交链孢（）是一种典
3、型的潜伏侵染菌，当其孢子接触到梨果表面，感知表皮信号如疏水、蜡质等的刺激后，孢子萌发并进一步分化形成侵染结构，进而启动侵染。研究发现胞内 蛋白介导的信号级联途 径、途 径、信 号 途 径 和 信号途径等主要信号通路对病原物感知外界信号进而启动侵染具有重要的调控作用。其中，信号途径是真核生物重要的细胞传导途径之一，被认为是许多生物细胞生长和发育必不可少的阳离子，真菌通过钙泵或 通道来控制细胞质中的 浓度。钙调磷酸酶 作为 信号转导途径中的重要元件，是一种丝氨酸苏氨酸（）蛋白磷酸酶，被激活后的 会使其下游的一些转录因子发生去磷酸化，从而在真菌生物学过程中起到调控作。另外，是目前所知唯一的一个活性受
4、 和 调控的蛋白磷酸酶，由一个催化亚基 和调节亚基 以等量比例聚合而成的异源二聚体。在钙调磷酸酶级联反应中，和 的调节亚基 充当 信号的传感器，细胞质中游离的 会与 形成 复合物，该复合物与钙调磷酸酶的催化亚基 和调节亚基 特异性结合，形成 复合物，产生功能性磷酸酶活性。是钙调磷酸酶特异性抑制剂，其可通过与免疫亲和蛋白 结合抑制 两个亚基活性，从而抑制钙信号级联反应。已有大量研究表明 参与到多种真菌的生长发育、孢子形成以及细胞壁合成。张世伟 研究发现在球孢 白 僵 菌 中 催 化 亚 基 会影响该菌菌落形态、分生孢子产生以及对杀菌剂咯菌氰的敏感性。李志勇等 利用 抑制剂环孢素 处理发现 参与调
5、控粟弯孢霉叶斑病菌 分生孢子的萌发。除此以外，在酿酒酵母 、大麦黑 粉菌 、玉 米 黑 粉菌 、尖孢镰刀菌 等真菌中发现 还参与真菌对逆境胁迫的响应，可见 在真菌中的调控作用因病原物而异，存在多样性和复杂性，且其在梨果黑斑病菌 中调控作用仍需进一步研究。甘肃农业大学采后生物学与技术团队已通过遗传学和药理学研究发现 信号途径中关键成分磷脂酶（）参与了梨果黑斑病菌营 养 生 长、孢 子 萌 发 以 及 致 病 力 调 控 过程。同时有研究发现 是柑橘褐斑病菌 发育和致病所必须的。为进一步探究梨果黑斑病菌 基因的结构和生物功能，本研究在对梨果黑斑病菌 中 的催化亚基 和调节亚基 基因克隆的基础 上，
6、对 其 进 行 生 物 信 息 学 分 析，通 过 进一步分析 在疏水及果蜡诱导 孢子萌发、附着胞形成等过程中的表达情况。同时用 抑制剂 处理 ，分析在疏水、蜡质等的诱导下 对 侵染结构形成的调控，并通过体内试验研究其对该病菌致病性的影响，以期进一步揭示 信号途径 中 关 键 成 分 在 疏 水 及 蜡 质 诱 导 侵染结构分化及致病性中具体的调控机理。材料与方法 材 料 供试菌株梨黑斑病病菌 菌株（），由甘肃农业大学采后生物学与技术实验室保存的菌种，经活化代后使用。供试果实早酥梨 采自甘肃省条山农场，挑选符合试验要求的早酥梨，于当天运至实验室，置于冷库贮藏，待用。方 法 梨果黑斑病菌 基因组
7、 及 的提取用液氮将新鲜菌丝研磨成粉末状，使用 提 取试剂盒进行 提取，用 试剂提取。将部分提取的 使用 （）试剂盒进行 合成。梨果黑斑病菌 和 基因克隆在 （：）下载 的钙调磷酸酶和的 基 因 序 列，利 用 设 计 和 的扩增引物（表），以 的 为模板进行目的基因扩增。和 基因序列和编码蛋白的生物信息学分析利用在线网址进行目的基因及其编码产物的生物信息学分析，预测网址如表所示。表扩增目的基因引物序列 基因名称 引物序列（）：表在线预测网址 在线软件 网址 基因结构 ：开放阅读框 ：理化性质 ：保守结构域分析 ：跨膜结构域 ：信号肽 ：亲疏水性 ：蛋白二级结构 ：蛋白三级结构 ：亚细胞定位
8、：磷酸化位点 ：期杨阳阳等：梨果黑斑病菌钙调磷酸酶基因生物信息学分析及其对侵染结构分化的调控作用 实时荧光定量 分析称取 果蜡溶至 氯仿，将疏水 膜（接触角为 ）剪切至盖玻片大小（），一部分疏水膜不作处理，在另一部分疏水膜上涂上 果蜡（接触角为 ），室温放置，使氯仿充分挥发。将上述两种疏水膜放置在载玻片上，然后在其上滴加 浓度为 孢子悬浮液，在黑暗条件下培养，分别在、取样。用 方法检测 中 和 基因在不同侵染结构形成的 个时间（、）中 转录水平。以磷酸甘油醛脱氢酶 （）为内参基因。扩增各片段所需引物见表。称取 果蜡溶至 氯仿，将疏水 膜（接触角为 ）剪切至盖玻片大小（），一部分疏水膜不作处理，
9、在另一部分疏水膜上涂上 果蜡（接触角为 ），室温放置，使氯仿充分挥发。将上述两种疏水膜放置在载玻片上，然后在其上滴加 浓度为 孢子悬浮液，在黑暗条件下培养，分别在、取样。用 方法检测 中 和 基因在不同侵染结构形成的个时间（、）中 转录水平。以磷酸甘油醛脱氢酶 （）为内参基因。扩增各片段所需引物见表。表基因定量引物序列 基因 引物序列（）：在疏水、蜡质条件下对 侵染结构形成的影响将 孢子悬浮液离心弃去上清液，然后向沉淀物中加入浓度为 溶液，以加入无菌水作为对照，震荡悬浮菌体。将处理好的孢子悬浮液（）分别滴在有、无蜡质处理的疏水性 膜面上，分别在、和计数孢子萌发率和附着胞的形成率。对 致病力的影
10、响选择大小均匀、无病无损伤的早酥梨果实，用的 溶液进行消毒 ，之后用蒸馏水冲洗，晾干，再用 的酒精对果实表皮进行擦拭消毒，然后用直径的打孔铁钉均匀的在果实赤道部位打个孔，每孔中接种上浓度为 的 孢子悬浮液，在接种后，处理组向每个孔中接入 的浓度为 溶液，无菌水作为对照。在室温下晾干，用规格为 ，厚 的市售保鲜袋包装，室温条件下，以十字交叉法每次，测果实的病斑直径，每个处理用果实个，每个处理分别重复次。数据分析采用 计算平均值和标准偏差并作图，用 进行 多重差异显著分析。结果与分析 和 基因克隆以梨果黑斑病菌 的 为模板，利用特异性引物 和 对其 进 行 扩 增（表），得 到 大 小 分 别 为
11、 左右的 和 左右的 （图）。；结果；结果 ；图 和 基因的克隆 和 蛋白的生物信息学分析 和 基因结构基因结构及 序 列 信 息 分 析表 明，基因全长为 ，包含个内含子和个外显子，内含子西北农业学报 卷长度分别为 、，其 区长度为 ，共编码 个氨基酸；基因全长为 ，包含个内含子和个外显子，内含子长度分别为 、，其 区长度为 ，共编码 个氨基酸（图）。图 和 基因结构 和 基因编码产物理化性质对 和 编码蛋白理化性质预测表明，分子质量为 ，化学式为 ，理论等电点为 ，负电荷残基数（）均大于正电荷残基数（），属于酸性蛋白，总平均亲水性（）小于，脂肪系数（）低于 ，不稳定系数（）大于，表明 属于
12、亲水性不稳定蛋白；分子质量为 ，化学式为 ，其等电点为 ，负电荷残基数（）大于正电荷残基数（），属于酸性蛋白，总平均亲水性（）小于，脂肪系数（）低于 ，不稳定系数（）小于，表明 属于亲水性稳定蛋白。和 结构域分析通过 网站在线分析 和 氨基酸序列的结构域，并通过 软件绘制 和 蛋白结构域，结果显示，钙调磷酸酶催化亚基 从 端到端依次是催化结构域（，），亚基结合螺旋（，），结合结构域（，），自 抑 制 结 构 域（，），其中后面个区域共同调节催化亚基的功能。是一个由 个氨基酸组成的多肽，属于 结合蛋白家族，个 离子结合位点填充个（图）。图 和 的结构域分析 和 系统进化树利用 下载了部分真菌的与
13、的同源物，通过邻近法进 行系 统发 育 树 的构建，值为 ，其余参数设置为默认值。结果表明，和 分别与 和 基因聚于同一分支，亲缘关系最近，同源性分别高达 和 （图）。和 跨膜结构域和亲疏水性 分 析利 用 预 测 和 蛋白的跨膜区域，结果显示，和 蛋白均无跨膜区，属于非跨膜蛋白（图、图）。利用 预测 和 蛋白的亲疏水性，图中正值区域表示疏 水 区 域，而 负 值 区 域 是 亲 水 区 域，发 现 和 整体亲水性氨基酸平均分值大于疏水性氨基酸，初步推测 和 蛋白均为亲水性蛋白（图、图）。期杨阳阳等：梨果黑斑病菌钙调磷酸酶基因生物信息学分析及其对侵染结构分化的调控作用图 和 的系统进化树 图
14、和 蛋白的跨膜结构域（、）和亲疏水性（、）预测 （，）（，）和 二、三级结构预测通过对蛋白的二级结构预测分析可知 二级结构含有 螺旋（蓝色）、延伸链（红色）、转角（绿色）和 无规卷曲（紫色）。二级结构含有 螺旋、延伸链、转角和 无规 卷 曲（图）。利 用 在 线 工 具 对 和 蛋白进行同源建模得到三级结构图（图）。和 亚细胞定位与 和 磷酸化位点分析利用 预测结果表明，和 均主要定位于细胞核上（表）。利用 在线分析工具预测 和 中的磷酸化位点，结果发现，蛋白存在 个丝氨酸磷酸化位点，个苏氨酸磷酸化位点和 个酪氨酸磷酸化位点。蛋白存在 个丝氨酸磷酸化位点，个苏氨酸磷酸化位点和个酪氨酸磷酸化位点
15、（图）。西北农业学报 卷图 和 的二（）、三级（）结构 （）（）表 和 亚细胞定位预测 蛋白名称 细胞核 细胞质 线粒体 过氧化酶体 质膜 高尔基体 图 和 蛋白的磷酸位点分析 期杨阳阳等：梨果黑斑病菌钙调磷酸酶基因生物信息学分析及其对侵染结构分化的调控作用 和 在疏水及果蜡涂膜表面诱导侵染分化中的表达分析 结果显示，和 基因在疏水、蜡质涂膜表面均显著上调，但诱导水平各不相同（图）。以 萌发初级阶段（）作为对照，表达量在侵染结构形成阶段均有所上调，在侵染菌丝形成阶段（）的表达量最高，其表达量在疏水和蜡质表面分别上调了 倍和 倍。表达量在侵染结构形成阶段呈现出先上升后降低的趋势，在附着胞形成阶段
16、（）的表达量达到峰值，其表达量在疏水和蜡质表面分别上调了 倍和 倍。竖线表示标准误（）。不同字母代表显著性差异（），下同 （）（），图 和 基因在侵染结构分化中的表达量 对侵染结构分化的调控 在疏水、蜡质条件下对 侵染结构形成的调控 抑制剂 处理显著降低 孢子萌发率和附着胞形成率，但相较于疏水表面，在蜡质表面 孢子萌发率和附着胞形成率较高。与对照组相比，使用 处理时，在疏水表面 孢子萌发率降低 ，附着胞形成率降低 ，而在蜡质表面 孢子萌发率降低 ，附着胞形成率降低 （图）。图 处理在疏水、蜡质诱导 孢子萌发率和附着胞形成率 ，对 致病力的调控使用 抑制剂 处理可抑制损伤接种 梨果黑斑病的扩展（图 ）。在第 天时，处 理 相 对 于 对 照 组 病 斑 直 径 减 少 。讨 论本试验从 中克隆得到 的催化亚基 和调节亚基 。通过生物信息学分析得出，这两个基因虽都为亲水性蛋西北农业学报 卷图 处理对早酥梨黑斑病扩展的影响 白，但两个蛋白的亲水程度不一样，而这与蛋白稳定性有一定的关系，分析得出 为不稳定蛋白，而 为稳定蛋白。通常认为蛋白质分子是否稳定是由螺旋和折叠结构决定，伸展结构和无规则卷
