1、中药与天然药物金银花抗炎质量标志物筛选鉴定及化学指纹图谱的研究刘征辉，赵琳琳，魏静娜，王瑞媛，汪伟，苏蘩，郭永泽，程奕（.天津市农业科学院，天津；.天津海世达检测技术有限公司，天津；.天津市现代中药质量检验中心，天津；.天津中新药业集团股份有限公司药材公司，天津）摘要：目的 研究金银花抗炎质量标志物筛选鉴定方法以及化学指纹图谱用于金银花药材品质判定及其伪品鉴定。方法利用人胚胎肾 细胞及核转录因子（）双荧光素酶报告系统进行抗炎活性实验，选择活性最优指标进行活性抗炎单体的筛选，并通过超高效液相色谱 四级杆飞行时间质谱法（）进行抗炎质量标志物的鉴定，对金银花进行化学指纹图谱分析，通过相似度软件处理，
2、判定指纹图谱相似度差异性。结果 筛出 个活性单体，并对这 个峰进行解谱，鉴定分别为绿原酸、木犀草苷、獐芽菜苷和獐牙菜苦苷作为金银花抗炎活性的质量标志物，同时结合异绿原酸、异绿原酸、马钱苷、芦丁、金丝桃苷等功能性成分进行化学指纹图谱识别研究，结果显示，批不同产地金银花指纹图谱相似度均大于.，具有良好一致性。结论 鉴定出 个成分作为金银花抗炎质量标志物评价的物质基础，金银花化学指纹图谱研究可用于金银花药材品质判定及伪品鉴定。关键词：金银花；抗炎；质量标志物；筛选；品质；化学指纹图谱；伪品鉴定中图分类号：文献标识码：文章编号：（）作者简介：刘征辉，男（）。学历：硕士。职称：副研究员。主要从事中药质量
3、控制及化学计量学方面的研究。通讯作者：程 奕，女。职称：研究员。主要从事农产品、土壤肥料及中药检测及科研工作。基金项目：年天津市重点研发专项京津冀三地协同创新研发项目（）；京津冀金银花质量控制关键技术及其深加工利用研究 ，（.，；.，；.，；.，.，）：.（）.，（）.，.，.，.，.，.海峡药学 年 第 卷 第 期：；金银花为忍冬科忍冬属多年生半常绿藤本植物忍冬（.）的干燥花蕾或初开的花，它性甘寒气芳香，甘寒清热而不伤胃，芳香透达又可祛邪，自古以来被誉为清热解毒的良药，并有“中药抗生素”之称。金银花是国务院确定的 种名贵药材之一，也是第一批纳入“药食同源”名录的中药。“金银花”一名出自本草纲
4、目，由于忍冬花初开为白色，后转为黄色，因此得名金银花。在中国的历代医学文献中，均发现有金银花及其药效的记载。中国药典 年版收载的金银花功效为：清热解毒、疏散风热，用于痈肿疔疮，喉痹，丹毒，热血毒痢，风热感冒，温病发热。中药指纹图谱是一种评价中药质量的切实可行的方法，是运用现代分析技术对中药化学信息以图像或图形的形式进行表征并加以描述，得到能够标示该中药特性的某类或数类成分图谱。通过特征指纹图谱能有效识别样品的产地或真伪；通过指纹峰峰面积或比例的测定，能有效控制样品的质量，确保样品批次之间的相对稳定。因此，在功效成分不完全明确时测定中药的指纹图谱，对于有效控制其质量非常有必要。用于中药指纹图谱评
5、价的技术方法有很多，包括薄层色谱法（）、高效液相色谱法（）、液质联用法（）、气相色谱法（）、气质联用法（）、红外光谱法（）等。中药指纹图谱的评价应考虑图谱的整体性和模糊性 个基本特性，故本研究对金银花药材的指纹图谱研究主要依靠超高效液相色谱法（）。中药材含有多类化学成分，其与中药的有效性和安全性密切相关，在一定条件下可作为反映中药质量的标志物。中药材的生物学因素或非生物学因素所形成的次生代谢产物是中药质量标志物的物质基础和发现新药的重要来源，。实验室利用 细胞及 双荧光素酶报告系统对金银花中各个峰成分进行活性筛选实验，对来自不同产地的金银花样品进行鉴定，并结合 方法进行进一步分析。仪器与材料.
6、仪器 超高效液相色谱仪串联四极杆 飞行时间质谱仪（，.工作站）；超高效液相色谱仪，色谱工作站，配置自动进样器、二极管阵列检测器、四元梯度泵。.试药对照品绿原酸（批号：，纯度：.）、木犀草苷（批号：，纯度：.）、金丝桃苷（批号：，纯度：.）均购自中国食品药品检定研究院；对照品异绿原酸（批号：，纯度：.）、异绿原酸 （批号：，纯 度：.）、马钱苷（批号：，纯度：）、芦丁（批号：，纯 度：）、獐 牙 菜 苷（批 号：，纯度）、獐牙菜苦苷（批号：，纯度）均购自成都瑞芬思有限公司；液相用水为 超纯水；色谱纯乙腈（公司）；色谱纯磷酸（天津化学试剂三厂）；分析纯乙醇（天津化学试剂三厂）。对金银花主产区及药材
7、市场进行调研，收集获得来自河北巨鹿县、天津蓟州区、北京房山区、河南封丘县、山东平邑县等地具有一定代表性的 份样本。经北京中医药大学中药学院李卫东教授鉴定为忍冬科忍冬属多年生半常绿木本植物忍冬 .的干燥花蕾，即本文所用样品。方法与结果.金银花 实验方法的建立采用超高效液相色谱仪串联四极杆 飞行时间质谱仪（，.工作站）建立了初步的金银花 图谱（见图）。查阅相关文献及建立合适条件的二级图谱，鉴定化合物结构。色谱条件：色谱柱：（.，.）；流动相：（）乙腈，（）.（）甲酸水溶液，梯度洗脱，程序为：，；，；，；，；，；，；，；，；，；流速为.；柱温：；进样 。质谱条件：电喷雾离子源（），分别采用正离子（负
8、离子）模式下检测；脱溶剂气为 ，脱溶剂气温度为，锥孔气为 ，离子源为 ，毛细管电压正离子为.（负离子为.），锥孔电压为 。.（间隔.）采集一次谱图；采用（.）作。.实验室金银花抗炎活性研究.通过 做金银花不同花期的 分析：图分别为正离子模式和负离子模式下的总离子流图，图为主成分分析的得分图，图为主成分分析的负载图。其中 图中四个花期的金银花分散度很高，说明四个花期金银花的特性相差很大，图共计算出 个贡献值大的。分别为（獐芽菜苦苷），（獐芽菜苷），（马钱子苷），（位异构马钱子苷），（位异构马钱苷酸），（绿原酸），（马钱苷酸），（断氧化马钱子苷），。说明正是这些 在不同花期的含量不同导致各花期差异
9、较大。.不同花期金银花的抗炎活性比较选用人胚肾上皮 细胞，置于 高糖培养基（含有 胎牛血清与 双抗），、的恒温培养基培养。待细胞融合至 时，加入适量胰酶，消化 后迅速加入 含 血清的高糖培养基终止消化。并于 离心 弃去上清液，用于以下转染实验。.图 上图为正模式总离子流图，下图为负总离子流图图 为金银花不同花期的质谱 图，为 图，为 图海峡药学 年 第 卷 第 期 取上述 孔板中培养的 细胞，将转染试剂脂质体 包合的 荧光素酶报告质粒（.）及内参荧光素酶报告基因质粒（）共转染入细胞内，控制每孔含有 的.与.的。其中转染试剂（）与.的摩尔比例为，转染 后即可进行后续实验。转染后以无血清培养液继续
10、培养 ，加入 造模，并设置空白对照组、模型组、阳性药地塞米松组（）、金银花提取液给药组（，），孵育 后用于 的检测。给药结束后弃去细胞培养液，使用 清洗 次，向 孔细胞培养板中加入 细胞裂解液，振荡 ，以充分裂解细胞。每孔吸取 细胞裂解液转移至.管中，再加入 配制好的萤火虫荧光素酶检测试剂，并于荧光检测仪检测记录荧光值。利用 细胞及 双荧光素酶报告系统做抗炎活性实验，结果表明不同花期金银花的抗炎活性差异较大，绿蕾期活性最好，用以活性抗炎单体的筛选。利用 结合 双荧光素酶报告系统，将绿蕾中各峰成分接出（每 接 个），进行活性筛选实验，筛出 个活性单体。这 个峰解谱鉴定为獐芽菜苦苷、獐芽菜苷、断氧
11、化马钱子苷、绿原酸、马钱苷酸、。将 个化合物在不同花期中的峰面积从 软件导出，将所有峰面积归一化，导入 软件得到 个峰在所有样品中的相对含量。结果表明，有抗炎活性的单体在绿蕾中的相对含量最高，在其它花期很少，与前期各个花期金银花中绿蕾抗炎活性最好的结果一致。综合实验结果说明：不同花期金银花的抗炎活性有很大差异，是因为几个抗炎活性单体在不同花期中的含量不同导致。这对金银花抗炎活性的品质鉴定有着重要的意义，选取 个抗炎指标成分作为质量标志物进行金银花多指标质量评价的物质基础。做 个 和 个活性单体（共 个）的相对含量图（热图），如图 所示。图 抗炎活性单体的相对含量图.金银花指纹图谱的研究.对照品
12、溶液的制备：称取异绿原酸、马钱苷、獐芽菜苷、木犀草苷、芦丁、金丝桃苷对照品适量，加 乙醇超声溶解，定容，摇匀，配制成质量浓度分别为.、.、.、.、.、.的对照品储备液。另称取绿原酸、异绿原酸 对照品适量于同一 量瓶中，精密加入上述对照品储备液各 ，然后加 乙醇超声溶解，定容，摇匀，得到绿原酸、异绿原酸、异绿原酸、马钱苷、獐芽菜苷、木犀草苷、芦丁、金丝桃苷质量浓度分别为.、.、.、.、.、.、.、.的混合对照品溶液，于 保存。.供试品溶液的制备：取金银花样品，粉碎，过 号筛，精密称取粉末.，置于 量瓶，加入 乙醇，称定质量，超声（功率 ，频率 ），放冷，再称定质量，用 乙醇补足减失的质量，摇匀，
13、过.有机相滤膜，待用。.色谱条件：超高效液相色谱仪，色谱柱（.，.）；流动相：（）乙腈，（）.（）甲酸水溶液，梯度洗脱，程序见表；流速为.；柱温：；检测波长；进样量 。.金银花指纹图谱的建立及共有指纹峰的确定：精密吸取绿原酸、异绿原酸、异绿原酸、马钱苷、獐芽菜苷、木犀草苷、芦丁、金丝桃苷的混合对照品使用液混合对照品溶液和制备的 批供试品溶液各 ，按照上述分析的色谱方法，分别注入 超高效液相色谱仪，记录 的色谱图。将 批金银花样品色谱指纹图谱 数据文件（.格式）导入国家药典委员会编开发的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，计算各指纹图谱间相似度。选取色谱图中 个较强峰，由数据分析系统辅助自动峰匹
14、配，确定 个共有指纹峰。以獐牙菜苷峰为参照峰（峰），通过 峰的保留时间和成分峰面积积分值作参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰积分面积，考察 批样品中相同成分峰相对峰面积的 值，符合指纹图谱的技术要求。图 金银花药材对照指纹图谱图 批次金银花 指纹图谱相似度评价图 .指纹图谱的相似度评价结果：将 批金银花色谱测定结果导入“国家药典委员会编中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件 版”进行分析，以 为参照图谱，中位数法，时间窗.，进行多点校正和自动匹配生成 批金银花药材的指纹图谱和对照图谱（）（见图、图），计算 批样品相似度，标定共有峰 个。结果 批样品有 批的相似度低于.（批均为河北采集金银花样
15、品），剩余 批均高于.。具有良好的一致性。结合以上地区分和总的指纹图谱相似度及共有峰的个数可以看出，单个地区的共有峰数目均高于总的指纹图谱的共有峰数据，单个地区之间的相似度大部分高于总的指纹图谱的相似度。河北的相似度较低的原因可能为样品量比较大，样品干燥方式的不同造成的。金银花药材对照指纹图谱如图 所示，批金银花 指纹图谱相似度评价如图 所示。讨论.本研究通过比较甲醇、水、乙醇等不同极性的溶剂以及常规加热回流法、超声提取法、冷热浸提法、微波萃取法等提取方法对金银花中有效成分提取效果的影响，结果以甲醇为提取溶剂，采用超声法提取，提取效果好且方法简便易行、重现性好。此外，对超声提取时间及乙醇浓度进
16、行优化，采用乙醇超声 提取金银花样品中绿原酸、异绿原酸、异绿原酸、马钱苷、獐芽菜苷、木犀草苷、芦丁、金丝桃苷等种有效成分，采用 技术可以标定共有峰 个具有所得指纹图谱信息量较大、化合物类别丰富等优势，既有清热解毒作用的有机酸类成分（绿原酸、异绿原酸、异绿原酸），又有抗氧化清除自由基的黄酮类成分（木犀草苷、芦丁、金丝桃苷），还有抗炎活性的环烯醚萜类成分（马钱苷、獐芽菜苷），因此符合指纹图谱整体性覆盖的原则和要求，能够反映金银花样品的大部分功能性成分的有效信息。.化学成分是中药质量控制的重要指标，其可测性也是中药质量标志物确定的重要依据。目前中药化学成分主要通过色谱技术手段来进行分析测定，金银花中化学成分结构复杂，利用色谱质谱联用技术对金银花质量标志进行鉴定及定量是金银花质量标志物研究的重要方向。本研究利用 细胞及 双荧光素酶报告系统筛选抗炎活性成分，并通过 进行抗炎质量标志物的鉴定。筛出 个活性单体，并对这 个峰进行解谱鉴定，确定分别为绿原酸、木犀草苷、獐芽菜苷和獐牙菜苦苷，基本确认了金银花抗炎质量标志物筛选鉴定方法，对金银花抗炎活性的品质鉴定有着重要的意义。参考文献国家中医药管理局中华
