1、，.，.基金项目：中央高校基本科研业务费资助项目（），（）：.胶原基生物材料制备与应用研究进展何晓棠，但 晔，陈一宁，王云兵，胡晓兵，李正军，但卫华，四川大学轻工科学与工程学院，皮革化学与工程教育部重点实验室，成都 四川大学生物医学工程技术研究中心，成都 四川大学机械工程学院，成都 国家生物医学材料工程技术研究中心，成都 胶原因具有良好的亲水性、柔韧性和趋化性、生物相容性、生物降解性，被认为是改善组织再生最重要的生物材料之一，并广泛应用于食品、化妆品以及再生医学领域。但是，在提取过程中，胶原的结构和自然交联键会遭到破坏，导致其机械强度、热稳定性和抗酶解能力都低于自然状态。受到天然胶原在组织重塑
2、和修复过程中自然交联的启发，研究人员通过引入外源性交联（化学、物理和生物）来优化胶原基材料的机械强度和稳定性。目前，外源性化学、物理或生物交联已被用于修饰胶原的分子结构，通过这些方法制备的胶原基支架材料的刚度、抗张强度和压缩模量都明显提高，但是材料的延展性降低。这些方法主要是通过限制胶原三螺旋结构分子间 链的自由度，防止胶原微纤维排列的破坏，从而提高胶原的热稳定性和机械强度。另外，通过分子间交联掩盖胶原的酶切割位点，能够提高胶原对酶促降解的抵抗力。但是这些方法仍然有一些缺陷，如存在细胞毒性和降低胶原的活性等。研究者们制备了不同物理结构的胶原基材料（脱细胞基质、海绵、水凝胶、自组装纤维、膜、管和
3、多孔球等），以更好地促进不同组织或器官的再生。因此，了解胶原基材料的交联方法和制备技术进展，对开发新型的胶原基生物支架材料至关重要。本文详细总结了制备胶原基材料的外源性交联方法及其优缺点，归纳了不同物理结构的胶原基材料制备方法以及它们在组织再生方面应用的研究进展，并对胶原基材料在再生领域面临的挑战以及未来的发展前景进行了展望。关键词 胶原 交联 生物材料 组织再生中图分类号：文献标识码：，（，），引言胶原是细胞外基质（，）的主要成分，具有可生物降解性、弱抗原性、良好的生物相容性以及独特的自组装特性。但是，因为提取过程会破坏胶原的结构和分子内的自然交联，所以提取的胶原的力学性能和稳定性均低于其自
4、然状态，这严重限制了胶原在再生医学中的应用。受到胶原自然交联的启发，科学家通过引入外源性交联剂来优化胶原材料的稳定性。理想情况下，引入其他交联键可防止胶原分子在应力作用下相互滑动，从而增加胶原 纤维的机械强度。交联能够改善胶原基生物材料的刚度、抗张强度、压缩模量和降低其延展性。有研究表明交联可显著提高胶原的热稳定性，通过胶原三螺旋结构分子间交联限制其 链的自由度，可有效防止由加热引起的微纤维排列的破坏。此外，通过掩盖胶原的酶切割位点（见图），分子间交联能够显著提高胶原对酶促降解的抵抗力。尽管交联能够改善胶原材料的诸多特性，但是至今还没有理想的交联方法既可以提高胶原材料的机械强度也不会降低其生物
5、相容性。图 胶原天然的和外源性交联示意图：（）胶原天然的首尾交联；（）引入外源性交联后（电子版为彩图）：（）；（）近年来，交联的胶原基支架已被广泛研究并用于临床促进组织再生或修复。众所周知，组织工程胶原生物材料可充当药物载体来加速自然修复过程，从而恢复损伤组织的功能。组织工程旨在改善损伤组织的自愈能力或提高其再生速度。因此，生物材料应模仿天然组织的微观结构，并提供一种支持性的仿生细胞外环境。针对以上要求，研究人员针对不同的组织再生修复开发了特定物理结构的胶原基材料。胶原的交联在体外很难重现体内的赖氨酰氧化酶介导胶原的交联，因此提取并制备的胶原基材料缺乏足够的机械强度，在加工和处理时容易被破坏，
6、在体内易降解。理想的组织工程支架材料的降解速率应与组织再生速率相匹配，为了达到这个要求，需要将化学、物理或生物的外源性交联引入分子结构中（见图），以调节力学性能和降解速率，防止变性。外源性交联的基本原理是使用化学、物理或生物交联剂在胶原分子之间形成共价键，该交联剂通常与胶原游离的胺基或羧基连接。尽管每种方法（化学、物理或生物方法）都有一定的优势，如增加变性温度、提高机械强度和抗酶解能力，但也会引起细胞毒性和异物反应。利用这些交联方法制备的胶原支架已广泛用于组织工程和再生医学。现对化学交联、物理交联和生物交联方法的研究进展进行详细的阐述。化学交联方法化学交联主要通过使用戊二醛、乙基（二甲基氨基丙
7、基）碳二亚胺（）、羟基琥珀酰亚胺（）和肉桂醛等将胺基或亚胺基连接起来。这会提高胶原基材料的机械强度，同时降低其免疫原性，但是某些醛交联剂可能导致细胞毒性和钙化。例如，戊二醛可以交联相距较远的游离胺，因此可以提高胶原类材料的结构稳定性。然而，即使使用甘氨酸溶液封闭未反应的醛基或者使用低浓度的戊二醛进行交联，得到的材料仍有细胞毒性且会引发钙化和异物反应。这使得研究者们开始寻找新的交联剂以替代戊二醛。大量报道显示，合成的和天然的醛衍生物以及 乙基（二甲基氨基丙基）碳二亚胺 羟基琥珀酰亚胺（）可以作为戊二醛的替代物来交联胶原基材料。使用 进行交联的机理是氨基酸侧链上的谷氨酸 天冬氨酸的羧基与相邻氨基酸
8、上的伯胺进行缩合反应，在不将化学试剂引入的情况下，这种交联被称为“零长度”交联，通常具有良好的生物相容性。然而，这种交联大大消耗了谷氨酸的羧酸根阴离子，会影响细胞在材料上的黏附。也有研究发现 交联可以调节细胞与材料的亲和力和作用模式，从而影响细胞的迁移、存活和生长。肉桂醛不仅可以提高材料的强度，还具有抗菌和消炎的作用，并促进成人牙髓干细胞（）的分化。天然存在的交联剂如褐藻中的阴离子嵌段共聚物（海藻酸）、栀子果实中的环烯醚萜类化合物、植物多酚（单宁）、二醛羧甲基纤维素、氧化羧甲基纤维素钠和双醛壳聚糖也被用于交联胶原基材料。与戊二醛和 相比，这些天然交联剂对提高材料的稳定性以及抗酶解能力效果有限。
9、另外，有研究报道，臂胺端聚乙二醇（）聚合物的胺基与胶原上游离的羧基可以形成共价键交联，与常用的交联剂（如 和戊二醛）相比，臂胺端聚乙二醇（）聚合物交联后的胶原材料显示出更好的细胞相容性，但这需要更多的研究来证明。物理交联方法物理交联方法主要包括脱氢热处理、紫外线、射线以及光反应剂。脱氢热处理是在真空条件下，将胶原加热到超过 后羧基与胺基反应，交联强度随温度升高而增加。需要注意的是，当温度超过 时，胶原会发生变性。与化学交联相比，加热过程会破坏胶原的三螺旋结构并降低其抗酶解能力。紫外线交联通过在酪氨酸和苯丙氨酸残基上形成的自由基来实现。交联机理是首先基于水形成羟基自由基（），然后羟基自由基（）攻
10、击肽主链以产生肽自由基（），后者可以相互作用形成交联网络。反应的效率主要取决于样品的类型、照射剂量和时间。与光敏剂（如核黄素）结合使用，紫外线照射能够在原纤维内和原纤维间引入共价键，这也被称为物理化学协 同 交联。但是，紫外线在交联过程中会导致胶原的构象改变甚至变性，降低材料的稳定性。据报道，在湿态条件下，紫外照射会使胶原纤维快速析出，这会增加材料的抗张强度。射线会在相邻的胶原纤维之间产生热稳定的分子间交联，其效果随辐射剂量、温度、水合条件和电子束强度而产生变化。与化学交联不同，物理交联后没有将交联剂掺入基质材料中，这会减少由交联剂本身引起的细胞毒性。但是与化学交联相比，物理交联的均一度低，交
11、联后材料的力学性能和热稳定性差，大规模使用物理交联也会大幅地提高生产成本。胶原基生物材料制备与应用研究进展 何晓棠等 图 胶原支架中化学、物理和生物交联机理的代表性例子 ，生物交联方法生物交联由于具有高度特异性和独特的反应动力学而引起了研究人员的极大兴趣。根据催化反应的类型，生物交联剂可分为氧化还原酶、转移酶和水解酶。目前研究较多的是转谷氨酰胺酶（）和辣根过氧化物酶（）。研究表明，转谷氨酰胺酶可以增强细胞的黏附、迁移、增殖和分化，并降低胶原的降解速度。转谷氨酰胺酶是钙离子依赖性酶，在很广的 值和温度范围内仍具有活性。源自微生物的转谷氨酰胺酶具有生物降解性、无细胞毒性并以浓度依赖的方式催化交联。
12、转谷氨酰胺酶具有修饰蛋白质的能力，可以将功能化的蛋白质引入胶原材料中，从而增加复合材料功能修饰的多样性。值得注意的是，尽管物理和生物学方法较化学方法具有优异的细胞相容性，但它们的交联强度低。因此，寻找最佳胶原交联剂的研究仍在继续。以上常用的交联剂均具有优缺点，详见表。化学交联由于具有交联均匀度高、交联能力强等优势是目前应用最广泛和最有效的方法，而物理交联通常被用作辅助交联手段。生物交联剂虽然具有较低的细胞毒性且不易导致胶原变性，但是价格昂贵和成本高限制了其广泛应用。尽管如此，这些交联剂依然广泛应用于组织工程和再生医学中，详见表。因此，为了制备出更好的胶原基生物材料，寻找开发更加有效和安全的交联
13、剂依然是当前研究的热点。胶原基支架材料大量的报道显示，胶原基支架材料已被广泛应用于不同组织器官的修复，如图 所示。科学家通常会模拟天然组织复杂的结构层次和机械完整性来制备胶原基支架材料。虽然脱细胞的组织可以达到最大的仿生效果，但是它们存在一定的免疫反应（同种异体移植和异种移植）。机械加载已被广泛用于制备有序且致密的胶原基支架材料，但是还需要进一步模拟天然组织结构的复杂性。静电纺丝可以制备 组织微环境支架材料，但是如何控制纤维的空间分布仍然具有挑战性，而致密的结构限制细胞的浸润，同时纺丝过程中使用的溶剂会导致胶原变性。本节简要概述了不同制造技术生产的胶原基生物材料如脱细胞基质、水凝胶、海绵、纤维
14、、膜、管以及空心球在组织再生中的研究进展。材料导报，（）：表 用于胶原基材料的各种交联剂的优缺点 交联剂优点缺点戊二醛可增加弹性模量非零长度交联剂，具有细胞毒性乙基（二甲基氨基丙基）碳二亚胺羟基琥珀酰亚胺可增加弹性模量，零长度交联剂丢失一些整合素特异性结合位点京尼平可增加弹性模量，无细胞毒性非零长度交联剂，赋予材料蓝色紫外线整合素结合不受影响，零长度交联剂具有非特异性反应位点，交联密度低核黄素可提高材料的生物化学和生物力学的稳定性丢失一些整合素特异性结合位点转谷氨酰胺酶 不仅可促进细胞的黏附、增殖和分化，而且可减少胶原蛋白的降解 可引起胶原蛋白超微结构的形态变化，降低材料的弹性模量表 胶原交联
15、剂在组织工程中的潜在应用 应用材料交联剂关键点参考文献角膜修复兔子角膜孟加拉玫瑰红（，质量分数）和绿光（）孟加拉玫瑰红和绿光交联的角膜显著提高了抵抗胶原酶的能力巴西莓提取物（，质量分数）巴西莓提取物交联的角膜不仅弹性模量增加了 倍而且显著提高了角膜的变性温度人髓核修复型胶原透明质酸水凝胶乙基（二甲基氨基丙基）碳二亚胺（，）乙基（二甲基氨基丙基）碳二亚胺交联的型胶原透明质酸水凝胶不仅提高了抵抗胶原酶的能力，而且显著促进了人髓核细胞的黏附和增殖关节修复自组装纤维软骨外源性赖氨酸氧化酶同系物 外源性赖氨酸氧化酶同系物交联的自组装纤维显著提高了其拉伸性能型胶原支架京尼平（、，质量分数）京尼平交联的型胶
16、原支架不仅提高了生物稳定性，而且显著促进了脂肪源干细胞的增殖和分化型胶原水凝胶柠檬酸乙基（二甲基氨基丙基）碳二亚胺 羟基琥珀酰亚胺质量比为 、柠檬酸乙基（二甲基氨基丙基）碳二亚胺 羟基琥珀酰亚胺交联的胶原水凝胶对穿刺引起的环状缺损具有良好的修复效果骨修复重组人型胶原肽脱氢热处理、六亚甲基二异氰酸酯和京尼平三种交联剂交联的重组人型胶原肽都促进了人骨髓间充质干细胞的成骨分化，证明了该材料作为骨修复材料的潜在用途矿化和未矿化的胶原糖胺聚糖支架乙基（二甲基氨基丙基）碳二亚胺 羟基琥珀酰亚胺矿化的胶原糖胺聚糖支架显著增加了骨钙素和骨唾液蛋白的表达神经修复型胶原京尼平（、，质量分数），戊二醛（、，体积分数）京尼平处理的胶原支架显著促进了背根神经节神经元的存活和轴突的生长，而戊二醛处理组则导致了大多数神经元的死亡皮肤修复来自病人的包皮京尼平和 乙基（二甲基氨基丙基）碳二亚胺（和 ）与碳二亚胺交联的胶原支架相比，京尼平交联的支架具有明显的稳定性软骨修复胶原京尼平碳点水凝胶京尼平（）京尼平交联后不仅增加了含有碳点纳米颗粒胶原水凝胶的硬度，而且具有良好的软骨修复效果壳聚糖胶原支架京尼平（、，质量分数）当壳
