1、第 41 卷第 1 期2023 年 2 月广东医科大学学报JOURNAL OF GUANGDONG MEDICAL UNIVERSITYVol.41 No.1Feb.20237酵母PHO8 与PHO13 双基因缺失酵母菌株构建 崔晓静1，2，杨晓迪1，2，袁頔3，王俊芳4，崔红晶1，4*（广东医科大学 1.医学分子诊断重点实验室衰老研究所；2.医学技术学院；3.第二临床医学；4.基础医学院，广东东莞 523808）摘 要：目的 构建碱性磷酸酶PHO8 与PHO13 双基因缺失酵母菌株。方法 依据基因同源重组原理，采用一步基因置换法构建编码Pho8 蛋白N 端 60 个氨基酸残基（包括跨膜结构域
2、）缺失的PHO8 基因缺失酵母（pho860）菌株；线性化载体pRS303-pho13-ko 转化pho860 菌株，进一步缺失PHO13 基因，构建pho860 和PHO13 双基因缺失（pho860pho13）菌株；通过缺陷型培养基筛选方法，PCR 鉴定阳性克隆基因组DNA。结果pho860 菌株电泳条带为1 151 bp 和 180 bp，pho860pho13 菌株电泳条带分别为 1 872 bp 和 174 bp。结论成功构建pho860pho13 酵母菌株。关键词：酿酒酵母；碱性磷酸酶；自噬；衰老 中图分类号：Q 255 文献标志码：A 文章编号：2096-3610（2023）01
3、-0007-05Construction of yeast strains with double-gene deletion of PHO8 and PHO13CUI Xiao-jing1,2,YANG Xiao-di1,2,YUAN Di3,WANG Jun-fang4,CUI Hong-jing1,4*(1.The Key Laboratory of Medical Molecular Diagnostics,Institute of Aging Research;2.College of Medical Technology;3.The Second School of Clinica
4、l Medicine;4.School of Basic Medicine,Guangdong Medical University,Dongguan 523808,China)Abstract:ObjectiveTo construct a yeast strain with double-gene deletion of alkaline phosphatase PHO8 and PHO13.MethodsAccording to the principle of gene homologous recombination,the encoding sequences of the N-t
5、erminal 60 amino acid residues(including the transmembrane domain)of Pho8 protein was deleted by one-step gene disruption,resulting that PHO8 deletion(pho860)strain was established.The double-gene deletion(pho860pho13)strain was established from the linear vector pRS303-pho13-ko transforming into th
6、e pho860 strain,resulting that the PHO13 gene was further deleted in the pho860 strain.PCR was used to identify the genomic DNA of the positive clones from the defective medium.ResultsThe 1 151 bp and 180 bp bands were detected by agarose gel electrophoresis from the PCR products of the genomic DNA
7、in the pho8 strain,and 1 872 bp and 174 bp bands were detected in the pho860pho13 strain.ConclusionThe yeast strain with double gene deletion of PHO8 and PHO13 pho860pho13 was successfully constructed.Key words:saccharomyces cerevisiae;alkaline phosphatase;autophagy;aging自噬作为细胞内的“清道夫”，是一种高度保守的 细胞内的细
8、胞自身分解代谢过程，降解衰老或损伤的细胞器、蛋白质等细胞成分，以维持细胞内物质和能量的稳态，促进细胞器的更新。自噬在肿瘤、癌症、炎症性疾病和某些类型的神经退行性疾病的发生和发展中具有重要作用1。此外，自噬在细胞衰老和寿命调节过程中的作用也日益受到关注2。单细胞真核生物酿酒酵母（Saccharomy cescerevisiae）成为研究自噬机制的首选模型系统3，在发现自噬相关基因作为自噬的中收稿日期：2022-10-21基金项目：国家自然科学基金（31701050，81971329），广东省自然科学基金（2022A1515010816），广东省医学科研基金（A2022368），广东医科大学博士启
9、动项目（B2017014），国家级大学生创新创业训练计划项目（20201057009）作者简介：崔晓静（1997-），女，在读硕士研究生，E-mail:通信作者：崔红晶（1979-），女，博士，副研究员，硕士生导师，E-mail:心调节剂和执行者方面发挥了开创性作用。酵母细胞中碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）由PHO8 和PHO13 结构基因编码4。通过测定ALP 活性研究非选择性细胞自噬水平是目前相对精确的定量方法5。为进一步研究细胞自噬水平，本文主要通过DNA 同源重组技术构建Pho8 蛋白 N 端 60 个氨基酸残基（包括跨膜结构域）缺失的PHO8 基因缺失
10、酵母（pho860）菌株，然后进一步构建PHO8 与PHO13 双基因缺失酵母菌株，为检测酵母细胞发生自噬后的ALP 活性奠定了广东医科大学学报82023年 第41卷基础。1材料和方法1.1菌株和质粒酿酒酵母 BY4742（MAT his31 leu20 lys20 ura30）、感受态大肠杆菌、载体pRS303 和pRS306 为实验室保存，pRS303 和pRS306 均为低拷贝穿梭载体，在大肠杆菌中具有氨苄青霉素抗性，分别带有His3 和Ura3 营养筛选标签。1.2试剂和引物Easy Taq DNA 聚合酶（货号：AP111-01）购自北京全式金生物技术有限公司，T4 DNA 连接酶和
11、限制性内切酶均购自TaKaRa 公司。引物由生工生物工程股份有限公司合成（表 1）。酵母提取物（货号：LP0021）和胰蛋白胨（货号：LP0042）购自广州威佳科技有限公司。SD 培养基（货号：630411 和 630412）和限制性氨基酸（货号：630414）均购自Clontech 公司。1.3方法1.3.1pho860 缺失酵母菌株的构建和验证6依据 基因同源重组原理，采用一步基因置换法构建基因缺失菌株7。利用 PCR 技术，以质粒 pRS306 为模板，pho860-box-F 和pho860-box-R 为引物，采用TransTaqTM HiFi DNA 聚合酶，反应体系按照试剂说明书
12、进行，PCR 反应条件为 94 5 min；94 30 s，58 30 s，72 1 min，33 个循环；72 5 min，扩增产物为破坏元件（含Ura3 编码序列）。PCR 产物回收纯化后，用醋酸锂方法转化野生型酵母BY4742，利用Ura3 缺陷型培养平板筛选阳性克隆。以阳性克隆基因组DNA 为模版，pho860-RT-F 和pho860-RT-R 为引物，采用Easy Taq DNA 聚合酶，反应体系按照试剂说明书进行，反应体系同上，PCR 方法验证pho860 基因缺失酵母菌株。1.3.2PHO13 基因缺失载体的构建和验证8以野生 型酵母细胞 BY4742 基因组 DNA 为模板，
13、PHO13-N-F/R 和PHO13-C-F/R 为引物，扩增酵母PHO13 基因开放阅读框两侧片段，分别命名为N 片段和C 片段。采用TransTaqTM HiFi DNA 聚合酶，反应体系按照试剂说明书进行。PCR 反应条件为：94，5 min；94，30 s、58，30 s、72，30 s，33 个循环；72，5 min，电泳检测扩增情况。PCR 产物回收纯化后，N片段进行Mlu 和BamH 双酶切，C 片段进行Mlu 和Xho 双酶切，酶切产物回收纯化。连接反应：连接体系按照试剂说明书进行，反应体系中骨架载体pRS303 为 100 ng（BamH 和Xho 双酶切），N 片段（Bam
14、H 和Mlu 双酶切）和C 片段（Mlu 和Xho 双酶切）各为300 ng。连接反应条件为：16，4 h，4 过夜。取 8 L 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆摇菌，提质粒，酶切鉴定。1.3.3基因缺失载体的转化与菌株验证9-10限制性内切酶 Mlu 酶切重组载体pRS303-pho13-ko，产物回收纯化后，采用醋酸锂方法将 5 g 线性化载体转化酵母pho860 菌株。用His 营养缺陷型培养基筛选阳性克隆。PCR 鉴定阳性克隆基因组DNA，采用Easy Taq DNA 聚合酶，鉴定引物第 1 组为pRS303 内部筛选标签引物Amp-int-F 和PHO13 下游 300 b
15、p 范围内的引物PHO13-R，第 2 组为PHO13 基因内部鉴定引物PHO13-RT-F 和PHO13-RT-R，反应体系和反应条件参照说明书进行。2结果2.1酵母pho860 缺失菌株的验证 通过一步基因置换法构建 pho860 酵母菌株。表 1本实验所用引物序列引物名称DNA 序列（5-3）pho860-box-FTATCAGCATACGGGACATTATTTGAACGCGCATTAGCAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACpho860-box-RTCACGAAGAATATGACATTCTTCTTCTTGTGTGATGCAGACTGTGCGGTATTTCACACCGpho860
16、-RT-FATGATGACTCACACATTACCpho860-RT-RACGTAATGCAAAACTGCTTGPHO13-C-FCTGCTCGAGAGGAGCAATGCAAAATCTAG（Xho）PHO13-C-RCCGACGCGTATCTTACCGAATTAGACAAT（Mlu）PHO13-N-FCAGACGCGTGGTTCCGATTTACTTAACCT（Mlu）PHO13-N-RCCGGGATCCTTTCCCGAGTTGTATATTCT（BamH）PHO13-RAGTGGACGATAAAGACGAAmp-int-FACAGGCATCGTGGTGTCACPHO13-RT-FAACTCTACCAAGTCCCGTPHO13-RT-RACCAATACCGCTTTCTCC第1 期崔晓静，等.酵母 PHO8 与 PHO13 双基因缺失酵母菌株构建 9图 1 A 为含有URA3 营养缺陷基因的PHO8 基因破坏元件，大小为 1 151 bp，与预期大小相符；图 1 B 为PCR 方法验证阳性克隆菌株的电泳图。引物pho860-box-F 和pho860-box-R 扩增PHO8 基因N 端 6
