1、北方园艺 （）：食 用 菌第一作者简介：刘月芹（），女，博士，讲师，硕士生导师，现主要从事微生物资源的开发及食用菌栽培等研究工作。：基金项目：国家自然科学基金资助项目（）；延安大学博士科学研究启动资助项目（）；陕西省科学技术厅资助项目（）。收稿日期：林下种植灵芝内生细菌和放线菌的分离鉴定刘 月 芹，罗 丽 媛，刘 欣 瑞，白鹭（延安大学 生命科学学院，陕西 延安 ）摘要：以林下种植灵芝为试材，采用 鉴定方法，研究了不同分离方法对灵芝内生细菌和放线菌多样性的影响，以期能够发现产生活性成分的菌种或者新种，从而推动微生物医药的发展进程。结果表明：从健康的灵芝子实体内分离得到放线菌门属的个菌株（、）和
2、细菌门属的个菌株（、）。株放线菌均属于链霉菌属（），株细菌分别属于周杆菌属（）、假单胞菌属（）、新根瘤菌属（）和芽孢杆菌属（）。该研究为其它食用菌内生菌的分离提供了技术支撑，也为灵芝活性成分的进一步开发利用提供了较好的参考价值。关键词：灵芝；内生菌；分离；鉴定中图分类号：文献标识码：文章编号：（）灵芝（.）属于担子菌门（），担 子 菌 纲（），多 孔 菌 目（），多孔 菌科（），灵 芝属（）的药用真菌。随着对于灵芝的深入研究，灵芝在医学、真菌学方面成为了新的研究热点之一。根据现代化学研究发现，灵芝中含有的生物活性化合物多达 多种，富含多糖、黄酮类、三萜类、甾醇类、生物碱和核酸类等。这些活性成分
3、具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、降血糖、降血脂、滋养利尿和保肝的功效。鉴于此，灵芝的市场需求日益增加。然而在当今野生灵芝极其匮乏的状况，促使“林下仿野生种植”这种新的种植模式悄然而生。这种种植模式不仅能疏松土壤，增加土地肥力，提高林地的利用率，改善林地生态环境，还能够带动林下产业的经济发展，因此林下种植灵芝具有较大的发展空间和发展前景。内生菌是在生活史的一定时期或整个生命周期均与宿主组织共同生活，不会引起宿主植物出现明显的病害现象的微生物。它们广泛存在于各种植物的各个组织和器官中，主要包括细菌、真菌以及放线菌，其种类繁多。研究表明，内生菌的合成代谢途径与宿主植物相同或相似，可以产生与宿主植物的代谢
4、产物结构相同或功能相似的化合物，这为天然药物的开发提供了一条崭新的思路。并且内生菌由于在宿主中长期存在并与宿主共同进化，与宿主建立了和谐的共生关系，宿主可以通过自身的生理活动为内生菌提供必要的营养物质，内生菌也能反过来为宿主提供营养并且增强宿主植物对外界不良环境的抵抗能力，所以，植物的内生菌是植物微生物系统宝贵的资源 。近年来，人们对于内生菌的筛选主要集中在植物体上，而对于食用菌中的内生菌研究较少。所以，为寻找更加丰富的内生菌类群，该试验以林下种植灵芝子实体为原材料，以灵芝子实体内部的微生物类群作为微生物组的研究对象，从健康、无虫害、新鲜的灵芝子实体的菌盖与菌柄个部分组织分离出放线菌和内生细菌
5、菌株，结合菌落形态学观察和 分子生物学快速鉴定的方法，旨在通过研究灵芝内生菌的多样性，寻找更加丰富的内生菌群，找出与灵芝的生长关联密切的以及能够产生与灵芝的代谢产物相同或相似的化合物有益的内生菌群，以期为今后新的微生物资源拓宽道路、推动新型微生物医药的创制发展。材料与方法 试验材料供试菌株。灵芝菌种（.）购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心（该菌株最适培养温度为）。灵芝菌袋于月下旬林下种植于陕西省延安市山牛生态园（北纬 ，东经 ，海拔 ），灵芝子实体于月中旬采集。以没有虫蛀、没有霉腐的、新鲜的灵芝子实体为采集对象，随机采样。供试培养基。培养基：，胰蛋白胨，酵母提取物，琼脂，去离子水定容至 ，。
6、高氏号培养基：可溶性淀粉，磷酸氢二钾 ，七水合硫酸镁 ，七水合硫酸亚铁 ，琼脂，去离子水 ，。供试试剂与仪器。酵母提取物、胰蛋白胨、琼脂粉、琼脂糖、葡萄糖、可溶性淀粉（天津科密欧化学试剂有限公司）；聚合酶、细菌基因组 小量提取试剂盒（上海生工生物有限公司）；电 泳 仪（美 国 有 限 公司）；超净工作台（苏州净化设备有限公司）；隔水式恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；仪（）（美国 公司）；全自动凝胶成像系统（美国 公司）；台 式 高 速 离 心 机（湖南湘仪仪器有限公司）。试验方法 灵芝子实体灭菌取新鲜的且品相良好的灵芝子实体，自来水冲洗掉表面的土壤，用无菌手术刀去除与土壤接触的子实体根
7、部。在超净工作台里进行灵芝子实体的消毒灭菌。子实体表面先用 乙醇消毒，无菌水冲洗次，滤纸干燥后用 乙醇浸泡 ，无菌水冲洗次，再用 次氯酸钠浸泡 ，无菌水冲洗子实体次，确保杀灭的表面微生物残留物被清洗干净。内生菌分离纯化子实体灭菌后，采用种方法进行内生菌的分离，一种是组织分离法：用无菌手术刀去除无菌的灵芝子实体表皮，取出内部组织，在直径 的无菌板上切成 的正方形菌块。然后将切下的组织块用无菌镊子分别放到 和高氏号平板培养基的中心，每个平板放置一个正方形菌块。另外一种是研磨法：将切好的 正方形菌块放入灭过菌的研钵中，加入石英砂和无菌水，充分研磨，静置 ，然后用移液枪吸取上清液 分别涂布于 和高氏
8、号平板培养基上。取最后一遍清洗过子实体的无菌水作为对照，对照组和试验组各个平行。各平板置于 恒温培养，待长出菌体后，对比对照组，根据菌落形态，用无菌接种环挑取单一菌落边缘少量的菌体，采取四区划线法进行单菌落的分离与纯化。纯化后的菌株保存于斜面培养基中，冰箱保存备用。内生菌形态学鉴定将上述分离纯化得到的单菌落进行形态学观察：比较菌落颜色、大小、边缘整齐度、表面透明度等特征。并参考 常见细菌系统鉴定手册，对获得的内生菌进行革兰氏染色镜检，根据菌落及细菌形态特点进行分类。内生菌分子生物学鉴定将纯化保藏的灵芝内生菌菌株分别转接到 和高氏号固体培养基上划线培养，待单菌落长成后挑取单菌落至相应液体培养基中
9、，摇瓶培养 后，利用细菌基因组 小量提取试剂盒进行内生菌基因组的提取。利用 完 整 基 因 的 通 用 引 物 （：；：购于北京擎科生物科技有限公司）进行 扩增。反应 条 件 为：预 变 性 ，变 性 ，退火，延伸 ，个循环，终延伸 。扩增产物经 的琼脂糖凝胶电泳检测，送到北京擎科生物科技有第第期期 北方园艺限公司测序。测得序列结果提交 。同源性分析及构建系统发育树将测序结果提交至 进行序列比对，然后再提交至 上获取菌株登录号，从 上下载模式菌株，利用 软件构建系统发育树。数据分析采用 和 软件进行图表的绘制和有关数据分析。利用 数据库进行菌株信息分析，利用 软件构建系统发育树。结果与分析 不
10、同分离方法分离的内生菌数试验主要采取研磨法和组织分离法种方法从灵芝中分离得到株内生菌株，分别编号为 、。其中分离得到的放线菌株，内生细菌株。由图可知，通过研磨法分离得到株细菌和株放线菌，而通过组织分离法只得到株细菌和株放线菌。试验结果表明，研磨法比组织分离法更有利于灵芝内生菌株的获得。图不同分离方法分离的内生菌株数 不同组织分离的内生菌数试验获得的株内生菌株来自灵芝的菌盖与菌柄部分，从灵芝菌柄中分离得到株细菌（、）和株放线菌（、），而从灵芝的菌盖中只分离得到株细菌（）和株放线菌（、）。由此可见，分离得到的内生菌的数量不同可能与不同组织分离的部位数量有关。图不同组织分离的内生菌株数 内生菌形态学
11、鉴定对分离得到的内生菌进行革兰氏染色，观察菌落形态特征，由表可知，分离得到的株细菌在菌落颜色、形态和大小等方面存在明显差异；在细胞形态方面，株细菌均是杆状，除 菌株为革兰氏阴性菌外，其它株均为革兰氏阳性菌。分离得到的株放线菌的菌落形态各有不同，但在细胞形态上均是丝状的革兰氏阳性菌。表菌落形态特征 菌株 菌落形态 细胞形态 粉红色，小而中心隆起，表面不光滑，有褶皱，较湿、杆状 乳黄色，大而平坦，表面不透明，较湿、杆状 淡黄色，小而中心隆起，边缘整齐，有光泽，较湿、杆状 乳白色，大而平坦，透明，边缘不整齐，很湿、杆状 白色，小而突起，表面粗糙不透明，较湿、杆状 表面干燥，小而紧密，无光泽，边缘呈扇
12、形、丝状 淡黄色，边缘不整齐，大而紧密，干燥、丝状 白色，大而紧密，不规则圆菌落，表面干燥、丝状 紫红色，小而紧密，不规则的圆菌落，中点凹陷，干燥、丝状 内生菌分子生物学鉴定 扩增利用 的通用引物对分离得到的菌种进行 扩增。由图可知，扩增的 片北方园艺月月（上上）注：；蒸馏水（阴性对照）；分离的株放线菌 、的 结果；分离的株细菌 、的 结果。：；（）；、；、图 扩增图谱 段无 拖 尾，无 杂 带，且 均 排 列 在 一 条 的直线上，可以看出分离得到的内生菌株 长度均为 左右。内生菌的不同分类阶元将分离得到的株菌株的测序结果提交至 数据库上进行序列比对，比对结果选择参照同源性最高的菌株序列。对
13、比对的结果进行不同的分类阶元梳理。由表可知，分离得到的株菌株中，其中放线菌株分类阶元比较单一，同属于一个分类阶元，均属于链霉菌，而不论从哪个阶元上，细菌内生菌的多样性均比放线菌高。由表可知，在分离得到的放线菌类群中，链霉菌属菌株数量最多，分离比例达 。在细菌类群中，芽孢杆菌属（）出现的频率最高，达到 。周 杆 菌 属（）、假 单 胞表不同分类阶元的内生菌多样性 类群 菌株 分类阶元 门纲目科属放线菌 放线菌放线菌链霉菌链霉菌科链霉菌 厚壁菌杆菌杆菌杆菌科周杆菌 变形杆菌蛋白杆菌 假单胞菌 假单胞菌科 假单胞菌细菌 变形杆菌变形杆菌根瘤菌根瘤菌科新根瘤菌 厚壁菌杆菌杆菌杆菌科芽孢杆菌菌（）、新根
14、瘤菌（），分离比各为。同时，发现从灵芝不同组织部位中分离出来的内生菌在属的水平上呈现出多样性的特点。其中，菌盖部分分离得到个属的放线菌和个属的细菌，菌柄部分分离得到个属的放线菌和个属的内生细菌，其中菌株 、来自灵芝菌盖，、来自灵芝菌柄。由此可见，菌柄内生菌的多样性程度比菌盖高。内生菌株同源性分析根据 分类标准，认为归于同一个种的 序列同源性大于，归于一个属的 序列同源性在 。对株内生菌进行同源性分析，同源性在 以上的菌株有 （）、（）、（）、（）和 （），同源性在 之间的菌株有 （）、（）、（）和 （）。在 上 对株内生菌的测序结果进行在线 对比分析，结果表明，和 分别为克氏链霉菌和浅紫链霉菌
15、，另外株放线菌也均属于链霉菌属。株细菌中的 、和 分别为壁芽胞杆菌、克氏假单胞菌和解蛋白芽孢杆菌，另外株 和 分别属于根瘤菌属和芽孢杆菌属。将株菌株的序列上传至 数据库第第期期 北方园艺上，填写菌株的相关信息，获取菌株登录号（、）。然后，将每株菌株的序列与 上公布的序列比对，利用 进行系统发育树的构建（图）。图灵芝内生菌系统发育树 .、和 分别处于一簇的个同级分支上，与 上登录号分别为 、的螺旋轮丝链霉菌菌株聚为一支，说明在系统发育上 与螺旋轮丝链霉菌菌株亲缘较近。与 上登录号分别为 、的公牛链霉菌菌株聚为一支，说明在系统发育上 与牛磺酸链霉菌菌株亲缘较近。与 上登录号分别为 、的螺旋霉素链霉
16、菌菌株聚为一支，说明在系统发育上 与螺 旋 霉 素 链 霉 菌 菌 株 亲 缘 较 近。与 上登录号分别为 、的浅紫链霉菌菌株聚为一支，说明在系统发育上 与 浅 紫 链 霉 菌 菌 株 亲 缘 较 近。、和 分别处于一簇的不同级别分支上，与 上登录号分别为 的壁周杆菌菌株聚在一簇，说明在系统发育上 与壁芽孢杆菌菌株亲缘较近。与 与 上 登 录 号 分 别 为 、的魏氏芽孢杆菌和稻壳芽孢杆菌菌株聚在一簇，说明在系统发育上 、与芽孢杆菌菌株亲缘较近。与 上登录号分别为 、的绿针假单胞菌菌株聚在一簇，说明在系统发育上 与 绿针假单胞菌菌株亲缘较近。与 上登录号分别为 、的碱性新根瘤菌菌株聚在一簇，说明在系统发育上 与碱性新根瘤菌菌株亲缘较近。通过上述序列比对分析可知，为克氏链霉菌，为暗黑微绿链霉，为牛磺酸链霉菌，为浅紫链霉菌，菌株为壁芽孢杆菌，为克氏假单胞菌，菌株为碱性新根瘤菌，菌株与解蛋白芽孢杆菌，为东洋芽孢杆菌（表）。北方园艺月月（上上）表灵芝内生菌株编号、登录号及菌株名称 ，.菌株编号 登录号 菌株名称 克氏链霉菌（）暗黑微绿链霉菌（）牛磺酸链霉菌（）浅紫链霉菌（）壁周杆菌（）克氏假单
