1、药学进展卵黄蛋白肽的研究现状与产业化应用闫昌誉，郑钧，王克祝，郑维新，龚海标，李怡芳，胡丹，何蓉蓉，栗原博（暨南大学药学院，中药与天然药物研究所，广东 广州；春雪食品集团股份有限公司，山东 莱阳）摘要：鸡蛋因其丰富的营养成为最受人们欢迎的日常食物之一，蛋白和脂质是其主要的营养成分。近年来，随着社会需求呈高层次化的发展趋势，人们在追求食品营养价值的同时，也十分关注食品的健康功能。因此，酶解技术制备的鸡蛋蛋白肽等鸡蛋深加工产品备受人们关注。卵黄提取磷脂后产生的副产物含有丰富的蛋白资源，但其利用率与附加值不高。很多研究证明卵黄肽具有抗氧化、降血压、骨保护等多种生物活性，在健康领域具有广泛的应用前景。
2、本文对卵黄肽的制备方法、生物活性以及产业化应用进行概述，旨在为卵黄肽的进一步开发与应用提供有益的参考。关键词：卵黄蛋白；卵黄肽；卵黄高磷蛋白肽；制备工艺；生物活性；产业化应用中图分类号：，文献标志码：文章编号：（）：基金项目：国家自然科学基金（）作者简介：闫昌誉，博士生，研究方向：药理学通信作者：栗原博，博士，教授，研究方向：中药药理和中医理论基础研究，：,(,;,):,:;我国是世界上鸡蛋产量最多的国家，鸡蛋含有蛋白质、脂质、维生素及矿物质等多种必需的营养成分，其中蛋白含量约占，且具有较好的健康功能，是人们最常食用的蛋白补充食品。蛋清（）中含有 左右的蛋白，包括卵 清 蛋 白（）、卵转铁蛋白
3、（）、类卵黏蛋白（）、卵黏蛋白（）及 溶 菌 酶（）等，这些成分具有极高的营养价值与生物功能，在食品、化妆品及医药等领域中被广泛应用。卵黄蛋白包括低密度脂蛋白（，）、高密度脂蛋白（，）、卵黄球蛋白（）以及卵黄高磷蛋白（）等成分。现代蛋黄加工技术提取卵磷脂或卵黄油后，卵黄蛋白会残留在附加值较低的副产物，其中丰富的蛋白资源没有被充分利用。现代酶解与发酵技术的进步推动了卵黄蛋白来源活性肽的生产制备，显著提升了其附加值。此外，近年来的体内外研究也逐渐揭示了卵黄肽潜在的生物活性，今日药学 年 月第 卷第 期与健康促进功能。过去，人们曾认为机体以氨基酸的形式吸收蛋白质，而近年来的研究发现小分子寡肽可直接被
4、肠道转运吸收。酶解技术制备生物活性肽可以产生特定的活性氨基酸序列，直接经胃肠道吸收后发挥原蛋白质不具备的生理功能，因此多种功能性食源活性肽被制备并投入生产应用。鸡蛋蛋白经酶解制备的低聚肽同样具备抗氧化、降血压、代谢调节及增强免疫等多种生理功能。人们也以脱脂的卵黄粉或纯化的卵黄高磷蛋白等为原料，利用生物酶解技术制备卵黄肽（，）和卵黄高磷蛋白肽（，）。本文就卵黄肽的制备方法、分离纯化、生物功能以及产业化应用等进行概述，为相关产业的发展提供有益的参考。卵黄蛋白的组成卵黄中蛋白约占总卵黄质量的，在卵黄浆质（）和卵黄颗粒（）中均有分布，其中含量最高的为低密度脂蛋白（），其次为高密度脂蛋白（）、球蛋白（）
5、以及卵黄高磷蛋白（）。低密度脂蛋白约含有 的蛋白与 的脂质，主要存在于卵黄浆质中，是一种粒径约 的球形颗粒，是蛋黄产生乳化作用的最主要成分。蛋白组分分析发现其中主要是脱辅基蛋白 和 的裂解片段。低密度脂蛋白常用作动物精液的冻融保护剂，与精浆中的脂质结合蛋白相互作用，减少其对精子细胞膜上胆固醇和磷脂的清除。卵黄高密度脂蛋白主要存在于卵黄颗粒中，具有相对高的蛋白含量（），是一种粒径为 的类球形脂蛋白。卵黄高密度脂蛋白由两类卵黄脂磷蛋白（和）构成，与高磷蛋白有较强的亲和力，有助于形成卵黄颗粒。卵黄球蛋白是不含脂质的水溶性蛋白，主要有 种存在形式，分别为、和，其中 具有免疫活性，又称免疫球蛋白（，），
6、作为抗体保护胚胎发育。卵黄高磷蛋白由 个氨基酸残基构成且被高度磷酸化，含有 个丝氨酸残基，其中 被磷酸化修饰，其磷含量约占整个蛋黄的。卵黄高磷蛋白因其较好的抗氧化、钙结合与抗菌等生物活性与乳化功能而被广泛研究。卵黄肽的制备生物酶解技术是制备活性肽的重要手段，通过水解蛋白质中的肽键释放小分子低聚肽。发酵技术相较于酶解具有成本低、绿色环保等优势，但因需要经过菌种筛选且产物质量不稳定等，尚未被广泛应用。目前的研究主要是通过酶解的方式制备卵黄蛋白肽，常用的底物形式一般是蛋黄提取卵磷脂后生成的副产物或分离纯化的高磷蛋白。卵黄肽的酶解制备酶解技术采用生物酶在温和条件下实现对蛋白质的降解，相对于热降解与化学
7、降解具有较大优势。近年来用于活性肽生产的蛋白酶种类日益繁多，根据其来源可分为胰蛋白酶（）、胃蛋白酶（）、胰凝乳蛋白酶（）等动物性蛋白酶；木瓜蛋白酶（）、菠萝蛋白酶（）等植物蛋白酶以及碱性蛋白酶（）、中性蛋白酶（）、嗜热菌蛋白酶（）等微生物蛋白酶。这些蛋白酶多为内切酶，水解肽键后会释放疏水性氨基酸末端，导致酶解物带有不良苦味，而像米曲霉菌来源的风味蛋白酶（）为外切酶，可以修饰末端氨基酸残基进而改善活性肽风味。以上蛋白酶已经进行商业化生产销售，易于获得，给研究和生产者带来了便利，但也有一些研究采用非商业化的蛋白酶进行酶解实验。等从亚洲南瓜（）的果肉中提取蛋白酶水解卵黄蛋白制备了具有抗氧化、抑制、葡
8、萄糖苷酶抑制活性的卵黄肽。此外，等使用固定化胰蛋白酶显著提高了高磷蛋白的水解度，制备的磷酸蛋白肽具有更好的钙结合活性，同时蛋白酶得以重复利用，减少酶分子在酶解物中的残留。酶发挥作用具有高度专一性，有选择性的酶切位点，因此筛选适宜的蛋白酶是高效制备活性肽的关键。蛋白酶的种类直接影响蛋白的水解度与活性肽组分，进而影响其物化性质、风味与活性。等分别比较了碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶对于卵黄蛋白的水解效率，发现碱性蛋白酶具有最高的水解度，且水解度越高其发泡与乳化性能越好。等通过 质谱表征高磷蛋白酶解物中的活性肽发现，胰蛋白酶相较于胃蛋白酶与嗜热菌蛋白酶产生了更多种类的活性肽，提示高磷蛋白中可能含
9、有较多的胰蛋白酶酶切位点。酶的水解工艺也影响其生物活性，在实际今日药学 年 月第 卷第 期，产品研发与生产中需要综合考虑资源利用率与产物活性等。此外，酶需要适宜的条件才能发挥最好的活性，酶浓度与反应温度、时间等均会影响蛋白的水解过程。因此，实验者常会优化酶解工艺以期达到最高的资源利用率或最好的生物活性，其中正交设计（）和响应面分析（）是常用的实验手段，以分析影响酶解过程的主要因素。由于制备活性肽的底物蛋白复杂多样，而单一酶作用位点有限，有时很难达到预期效果。采用复合酶可以很大程度上提高蛋白的水解效率，不同的酶发挥协同作用不仅增加蛋白水解度，酶切位点的多样性也能产生更多种类的活性肽段。几项研究采
10、用多酶水解的方式制备卵黄肽，其复配形式见表。然而，过度的水解会导致酶解物中游离氨基酸的比例增加，不利于小分子寡聚肽的产出，酶的复配方式与工艺需要筛选优化。不同的酶需要的反应条件不同，多酶的联合使用往往需要分步进行，且先后顺序也影响蛋白的水解与产物的活性。等发现相较于“中性蛋白酶胰蛋白酶”“胰蛋白酶中性蛋白酶”水解获得的卵黄肽具有较好的免疫调节作用，可显著增强巨噬细胞的吞噬能力。表 酶的复配形式底物酶参考文献，卵黄肽的发酵制备微生物发酵是选取合适的微生物菌种将蛋白进行发酵产生具有活性的小分子肽的过程。微生物发酵可以分为蛋白酶合成和酶解两个部分，初期主要是微生物大量生长繁殖合成分泌多种蛋白酶，后期
11、蛋白酶对蛋白进行消化降解。微生物发酵具有成本低、生产效率高、绿色环保等优势。然而，仅有 项最新的研究采用发酵技术制备卵黄蛋白肽，乳酸菌（和）发酵显著增强了高磷蛋白的乳化与乳化稳定性以及钙结合能力。微生物来源的蛋白酶实际上已经应用于卵黄肽的制备，除碱性蛋白酶、中性蛋白酶等商业化的蛋白酶，一些非商业化的微生物蛋白酶也能有效水解卵黄蛋白。等使用 酵母来源的丝氨酸蛋白酶与天冬氨酰蛋白酶水解卵黄蛋白，发现前者制备的卵黄肽具有更好的抗氧化和 抑制活性，并鉴定活性氨基酸序列。研究者也采用、等微生物蛋白酶水解卵黄高磷蛋白和，制备了具有 自由基清除、铁螯合与还原性的抗氧化活性肽。卵黄蛋白的前处理卵黄高磷蛋白中大
12、量的磷酸基团使其对蛋白酶水解产生拮抗，因此在制备高磷蛋白肽时一般添加柑橘磷酸酶、碱性磷酸酶或氢氧化钠等碱试剂进行去磷酸化处理来提高酶解效果。等采用磷酸酶处理高磷蛋白后，不仅提高酶解物中小分子肽的含量，还增强了其 抑制与抗氧化活性。然而，磷酸基团对于高磷蛋白肽发挥乳化性能与金属螯合作用至关重要，因此在以高磷蛋白肽为原料制备相关功能的产品时需要控制去磷酸化的程度。此外，等采用多次冻融处理高磷蛋白，增强了酶解制备磷酸蛋白肽的钙结合能力以及对过氧化氢（，）诱导肝细胞氧化损伤的保护作用。显微镜结构分析发现多次冻融处理下高磷蛋白发生了变性、解离和一定程度的聚集，空间形态结构的改变可能有助于与蛋白酶的接触。
13、高压加工技术在生物活性肽制备领域具有广泛应用，相较于传统的高热处理，条件温和几乎不损害产物的活性，且符合当今时代绿色环保的发展理念。高压通过诱导底物蛋白结构的展开影响其与酶分子间的相互作用，促进两者的结合从而提高酶解效率。研究表明酶解过程中 的高压不仅能增加高磷蛋白的水解度，还能增强高磷蛋白肽的自由基清除能力与还原活性等抗氧化作用。此外，果胶的结合也改变了高磷蛋白的结构，使其暴露更多的疏水性氨基酸残基，同时也增强了酶解制备高磷蛋白肽的钙结合能力。卵黄肽的分离纯化与结构鉴定卵黄蛋白的酶解产物是一种混合物，包括未降解的蛋白、多种不同水解程度的肽段、酶分子以及游离氨基酸等，因此需要采用技术手段将其中
14、的活性肽分离富集。此外，卵黄肽的分离纯化有助于研究者分析其发挥活性的物质基础，找寻活性最好的活性肽片段。质谱的应用能够快速鉴定活性肽中的小，今日药学 年 月第 卷第 期分子肽结构，在氨基酸序列的层面上探究构效关系。活性肽分离纯化常用的方法主要包括如下几种。膜分离技术（）是采用半透膜将混合物中不同粒径的物质进行选择性分离，根据半透膜的孔径大小可以分为微滤（）、超 滤（，）、纳 滤（）和反渗透（），其中超滤在生物活性肽领域应用最为广泛。超滤是在压力推动下，利用特定孔径的超滤膜高效快速地将不同分子量的肽段分离。研究表明超滤截留不同分子量的卵黄肽与高磷蛋白肽片段抗氧化活性有所差异，其中小于 肽片段的抗
15、氧化活性显著强于大于 的肽片段以及总酶解物。超滤往往作为分离活性肽的第一步，为后续的柱分离提供可分析的样品。此外，超滤步骤简单快速、成本低、绿色环保、容量大，适合工业化大批量生产。凝胶 过 滤 色 谱（，）又叫分子筛层析，采用葡聚糖等具有网状结构的凝胶颗粒为固定相，根据分子量大小差异将混合物进行分离，大分子难以进入凝胶孔先流出，而小分子可以进入凝胶孔后流出。但凝胶过滤色谱上样体积小，且需要严格控制流速，分离效率较低。离子交换色谱（，）是根据荷电性的差异将不同物质分离，以离子交换剂为固定相，在特定的流动相条件下样品离子与流动相离子竞争性结合固定相表面的电荷位置，结合能力弱的组分先流出，结合能力强
16、的组分后流出。不同活性肽分子因在氨基酸组成上有差异因而分子量大小与电性有所不同，适用于以上两种方法。高效液相色谱（，），是在高压流动相下将不同极性的物质分离，其中非极性固定相与极性流动相结合的反相高效液相色谱（，）在活性肽分离中应用广泛。高效的分离效果可获得单一活性肽组分，用于后续的质谱结构鉴定。液相色谱与质谱的串联使用可实现多组分的快速分离与鉴定，等将高磷蛋白酶解物的离子交换色谱分离片段进行质谱分析，表征了 个低聚肽的序列结构。研究者们常采用多种分离纯化方法，鉴定了多种活性肽的氨基酸序列，见表。卵黄肽的生物活性 抗氧化作用研究表明不同工艺制备的卵黄肽与高磷蛋白肽多具有较好的抗氧化活性，主要表现为自由基清除、铁螯合与还原能力，见表。高磷蛋白肽还能够抑制亚油酸的氧化，氨基酸成分分析提示其抗氧化活性可能与高含量的组氨酸、蛋氨酸和酪氨酸有关。此外，卵黄肽的两个凝胶过滤层析片段也具有抑制油酸氧化的活性，减少硫代巴比妥酸反应物（，）的生成。高磷蛋白肽还能抑制芬顿反应（）释放高氧化活性的羟基自由基，与其铁螯合的作用有关。一些抗氧化活性肽的序列已经被鉴定，见表。表 已鉴定的卵黄肽活性序列活性序列底物
