1、毛叶苕子磷饥饿响应基毛叶苕子磷饥饿响应基因因 VvPHR1 的克隆及功能研究的克隆及功能研究毛琳琳1，朱瑞利1，易可可1，段志龙2，王秀斌1，周卫1，孙静文1*（1中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京100081/农业农村部植物营养与肥料重点实验室；2延安市农业科学研究所，陕西延安716000）摘要:【目的目的】磷饥饿响应因子 PHR(phosphatestarvationresponse)在植物根系发育和磷养分吸收中起重要作用，本研究主要阐明毛叶苕子 VvPHR1 基因生物学功能，为培育磷高效型绿肥作物提供理论依据。【方法方法】通过转录组测序获得毛叶苕子 VvPHR1 基因序列。采用
2、酵母单杂交方法验证 VvPHR1 基因的转录激活功能，构建其过表达载体，利用花粉管通道法分别遗传转化野生型和突变体(Atphr1)拟南芥，获得超量表达 VvPHR1 基因和突变体功能回补转基因材料。对正常磷(1mmol/LPi)和低磷(1mol/LPi)的培养基中生长 30 天的拟南芥取样，采用实时荧光定量 PCR 对野生型和转基因拟南芥中 VvPHR1 及下游磷转运基因的表达进行分析，并对转基因材料进行表型分析，测定其主根长、鲜重、总磷及无机磷(phosphate，Pi)含量。【结果结果】毛叶苕子转录组中有 13 个 PHR 基因，转录本 129590、96227、120424 与拟南芥的
3、PHR1 相似度最高，其中转录本 120424 在低磷诱导下表达量最高，将该转录本命名为 VvPHR1 基因。该基因 cDNA 全长 1008bp，编码 335 个氨基酸，推测编码蛋白的分子量为 36.5KD，等电点为 6.04。系统发育树构建结果显示，该基因与蒺藜苜蓿和大豆 PHR1 基因的亲缘关系较近。亚细胞定位分析表明，VvPHR1 基因定位在细胞核中。酵母单杂交结果显示，VvPHR1 基因在酵母细胞中具有转录激活活性，能够激活下游报告基因表达。实时荧光定量 PCR 结果显示，与野生型相比，低磷胁迫下转 VvPHR1 基因拟南芥中 VvPHR1 基因及其下游调控的磷转运蛋白基因的表达量均
4、显著上调。进一步研究转 VvPHR1 基因植株表型发现，在正常磷培养基中，野生型与转 VvPHR1 基因型拟南芥，以及突变体与突变体回补型拟南芥之间植株长势、主根长、全磷和无机磷含量均无显著差异；而在低磷培养基中，转 VvPHR1 基因拟南芥与野生型及突变体回补型拟南芥与突变体相比，主根更长，且植株全磷和无机磷含量均显著增加。【结论结论】毛叶苕子 VvPHR1 基因定位在细胞核中且具有转录自激活活性，具有转录因子的功能特征。在低磷条件下，VvPHR1 基因在转基因拟南芥的表达显著上调，能够促进根系伸长和增加植株对磷吸收，与拟南芥AtPHR1 基因有相似的功能。关键词:毛叶苕子；磷饥饿响应因子；
5、转录因子；低磷胁迫Cloning and functional study of VvPHR1 gene involved in phosphatestarvation response by Vicia villosaMAOLin-lin1,ZHURui-li1,YIKe-ke1,DUANZhi-long2,WANGXiu-bin1,ZHOUWei1,SUNJing-wen1*(1 Institute of Agricultural Resources and Regional Planning,Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Lab
6、oratory of PlantNutrition and Fertilizer,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Beijing 100081,China;2 Yanan Institute of AgriculturalSciences,Yanan,Shaanxi 716000,China)Abstract:【Objectives】Phosphatestarvationresponse(PHR)playsanimportantroleinplantrootdevelopmentandphosphorus(P)nutrition.Thisst
7、udywasconductedtoclarifythebiologicalfunctionsofthe PHR1geneinVicia villosaandprovideatheoreticalbasisforcultivatinghigh-phosphorusefficiencygreenmanurecrops.【Methods】WeobtainedtheVvPHR1genesequencebyRNA-seqtechniqueandverifiedthetranscriptionalactivationofthegenebyusingayeastsinglehybridizationmeth
8、od.TheoverexpressionvectoroftheVvPHR1genewasconstructedandgeneticallytransformedintothewild-typeandmutant(Atphr1)Arabidopsis thalianaby植物营养与肥料学报2023,29(1):97108doi:10.11674/zwyf.2022441JournalofPlantNutritionandFertilizershttp:/www.plantnutrifert.org收稿日期：20220821接受日期：20221130基金项目：国家自然科学基金项目（31972514
9、）；农业农村部绿肥产业技术体系（CARS-22-G-07）。联系方式：毛琳琳E-mail:；*通信作者孙静文E-mail:thepollen-tubepathwaymethod.ExpressionsoftheVvPHR1geneanddownstreamphosphatetransporterinwild-typeandtransgenicArabidopsis thalianaweregrownfor30daysinnormal(1mmol/LPi)andlowPi(1mol/LPi)mediaandanalyzedbyreal-timefluorescentquantitativePCR
10、.PhenotypeandphysiologicalindicesoftransgenicArabidopsis thaliana,suchasmainrootlength,freshweight,totalPandPicontentswereanalyzed.【Results】Therewere13PHRgenesinVicia villosatranscriptome,andtranscripts129590,96227,and120424hadthehighestsimilaritywiththePHR1geneofArabidopsis thaliana.Theexpressionle
11、veloftranscript120424wasthehighestunderlowPistress;thus,itwasnamedtheVvPHR1gene.ThefulllengthofVvPHR1cDNAwas1008bp,encoding335aminoacidproteinswithaputativemolecularweightof36.5KDandanisoelectricpointof6.04.ThephylogenetictreeresultsshowedthatthisgenewascloselyclusteredwiththePHR1genefromMedicago tr
12、uncatulaandGlycine max.Subcellularlocalizationanalysisshowedthatthisgenewaslocalizedinthecellnucleus.YeastsinglehybridizationexperimentsindicatedthattheVvPHR1genehadtranscriptionalauto-activationandcouldactivatedownstreamreportergeneexpression.Theresultsofreal-timePCRshowedthattheexpressionofVvPHR1i
13、ntransgenicArabidopsis thalianawas(P0.05)enhancedunderlowPitreatment,andtheexpressionofdownstreamphosphatetransportersintransgenicArabidopsis thalianawas(P0.05)inplantgrowth,mainrootlength,totalPandPicontentsbetweenwild-typeandoverexpressedVvPHR1Arabidopsis thaliana,aswellasbetweenmutantandmutantbac
14、k-complementedArabidopsis thalianainnormalPitreatments.InlowPitreatments,mainrootlength,totalP,andPiofoverexpressedVvPHR1andmutantback-complementedArabidopsis thaliana(P0.05)increasedcomparedwiththewild-typeandmutantArabidopsis thaliana.【Conclusions】TheVvPHR1geneislocalizedinthecellnucleusandhasatra
15、nscriptionalauto-activationfunction,aspecificbiologicalcharacteristicoftranscriptionfactors.ExpressionoftheVvPHR1geneisupregulatedintransgenicArabidopsis thalianaunderlowPiconditions.TheVvPHR1genehasasimilarfunctiontotheAtPHR1geneandcouldpromoterootelongationandincreasePiuptakeinplantsunderlowPitrea
16、tment.Key words:Vicia villosa;phosphatestarvationresponse;transcriptionfactor;lowphosphorusstress磷是核酸、脂质、糖类等生物大分子的重要组成部分，在细胞代谢活动、酶的调控反应中起着至关重要的作用13。尽管在土壤中磷含量丰富，但其扩散速率较低，易被金属离子固定，不易被植物吸收利用4,因此土壤中磷的有效性并不高。在低磷环境下，植株生长缓慢、矮小且瘦弱，同时生育期延迟，并最终导致农作物减产5。在生产中通常会施用磷肥来解决作物缺磷问题，但当季磷肥利用率并不高，通常在 10%25%，同时过度施用磷肥会造成磷矿资源枯竭和水体富营养化等负面影响6。因此，提高植物自身对磷的吸收显得尤为重要。多年来，育种学家们通过杂交育种或分子改良等方法来提高作物对磷的吸收和利用能力以提升作物对低磷环境的适应性78。PHR 基因是植物响应低磷胁迫的关键调控因子，可通过启动下游基因的表达来提高植物对磷的吸收，被启动的功能基因主要包括促进根系伸长基因和磷的转运蛋白基因等910。PHR 基因对下游基因的调控作用最早在拟南芥中报道，
