1、黑龙江医学2023年1月25日第47卷第2期HEILONGJIANG MEDICAL JOURNALJan.25,2023Vol.47No.2论著哮喘是一种常见的气道炎症性疾病，以反复阻塞气道为特征，与黏液分泌过多和气道炎症细胞浸润有关。目前，全球哮喘患者超过3亿多人，且数量逐年上升1。目前治疗哮喘的方法主要是使用吸入皮质类固醇、长效2抑制剂等药物。但目前关于哮喘的治疗过程中，部分治疗的疗效不确定，且因药物的副作用，患者依从性比较差2。因此有必要探究新的药物控制哮喘的症状。Toll 样受体（Toll-like receptors 4，TLR4）是一种模式识别受体，研究报道OVA激活Toll样受
2、体通路及其下游靶点核因子B 蛋白（Nuclear Factor Kappa-B，NF-B），引起Th2相关哮喘炎症反应的加重和炎症细胞因子基因表达，NF-B是一种多细胞转录因子，在调节炎症和免疫反应中也起着重要作用3。抑制NF-B可以减轻卵清蛋白（OVA）诱导的过敏性哮喘4。木犀草素（Luteolin，LT）以糖苷的形式存在于多种植物中，这些植物以全叶青兰、辣椒、野菊花、金银花、紫苏含量较高，具有镇咳和祛痰作用。据最新研究，呼吸道症状咳嗽、咳痰、喘息，均与气道慢性炎症有关，如支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、慢性咽炎、变应性鼻炎等引起咳嗽、咳痰、喘息，均被认为与局部的炎症浸润有木犀草素通过TLR4
3、/NF-B途径对哮喘模型幼鼠炎症的影响刘克新1，龚本新2，何飞雪1，黎胜年1，郑英1，雷华凤11.中国科学院大学深圳医院（光明）东院区儿科，广东深圳518000；2.中国科学院大学深圳医院（光明）妇幼保健部，广东深圳518000摘要 目的：探究木犀草素（luteolin，LT）通过 TLR4/NF-B 途径对 OVA 诱导幼鼠哮喘模型的炎症的影响。方法：将40只SD雌性小鼠随机分为正常组、模型组、木犀草素组。小鼠通过第1 d、7 d腹腔注射卵清蛋白的乳化液，第15 d、16 d、17 d、18 d、19 d雾化吸入含3%OVA的生理盐水，建立哮喘模型。第15 d，LT组每天腹腔注射1 mg/k
4、g、2mg/kgLT；模型组、正常组注射等体积生理盐水。第30 d采用小鼠无创肺功能仪检测小鼠气道高反应，ELISA测血清IL-2、IL-4浓度，HE染色观察肺组织炎症变化，RT-PCR检测肺组织TLR4、NF-B的RNA表达，免疫印迹检测肺组织TLR4/NF-B pP65蛋白表达。结果：木犀草素组的气道高反应和血清IL-4浓度低于模型组，血清IL-2浓度高于模型组。与模型组比，肺组织中，木犀草素组肺部炎症改善，木犀草素组TLR4、NF-B的mRNA和蛋白表达低于模型组。结论：木犀草素通过调控TLR4/NF-B途径抑制幼鼠哮喘模型的炎症反应。关键词木犀草素；下游靶点核因子B蛋白；哮喘；幼鼠；炎
5、症doi10.3969/j.issn.1004-5775.2023.02.001学科分类代码320.2415中图分类号R562.2+5文献标识码BEffects of Luteolin on Inflammation via TLR4/NF-B Pathway in Young Rats in an Asthma Model/LIU Ke-xin,GONG Ben-xin,HE Fei-xue,et al./Department of Pediatrics,East Campus of Shenzhen Hospital(Guangming),University of Chinese Aca
6、demy of Sciences,Shenzhen Guangdong,518000,ChinaAbstract Objective:To investigate the effect of luteolin(LT)on inflammation via the TLR4/NF-B pathway in an OVA-induced asthma model in young rats.Methods:40 SD female pups were randomly divided into normal group,model group,and lignocaine group.The as
7、thma model was established in rats by intraperitoneal injection of emulsion of ovalbumin on day 1 and 7,andnebulized inhalation of saline containing 3%OVA on day 15,16,17,18 and 19.On the 15th day,1 mg/kg and 2 mg/kg lignocainewere injected in the lignocaine group,and equal volumes of saline were in
8、jected in the model and normal groups,respectively.Onthe 30th day,the airway hyperresponsiveness of mice was detected by non-invasive lung function instrument,serum IL-2 and IL-4concentrations were measured by ELISA,inflammatory changes in lung tissues were observed by HE staining,RNA expression ofT
9、LR4 and NF-B in lung tissues was detected by RT-PCR,and TLR4/NF-B pP65 protein expression in lung tissues was detectedby immunoblotting.Results:The airway hyperresponsiveness and serum IL-4 concentrations were lower in the lignocaine groupthan in the model group,and serum IL-2 concentrations were hi
10、gher than in the model group.Compared with the model group,inlung tissue,lung inflammation was improved in the lignocaine group,and mRNA and protein expression of TLR4 and NF-B werelower in the lignocaine group than in the model group.Conclusion:Lignocaine suppresses inflammatory responses in a youn
11、gmouse asthma model by modulating the TLR4/NF-B pathway.Keywords Luteolin;Downstream target nuclear factor-B protein;Asthma;Young rat;Inflammation133黑龙江医学2023年1月25日第47卷第2期HEILONGJIANG MEDICAL JOURNALJan.25,2023Vol.47No.2关。炎症的存在使得气道的免疫应答混乱，患者常出现气道反应性增高，治疗的手段首先应该消除气道的慢性炎症浸润。目前常用糖皮质激素消除气道炎症，但糖皮质激素的副作用较
12、多，不宜长期应用。研究表明，LT抑制巨噬细胞磷酸化，抑制转录因子NF-kB的活性，能够抑制脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞产生细胞因子IL-6，TNF-。后两种细胞因子在炎症机制中扮演非常重要的角色，是反映炎症程度的敏感指标。LT 还能提高 IFN-，降低特异性IgE，减少嗜酸性粒细胞的浸润。另外，LT除了抗炎、抗过敏作用以外，还具有抑制PDE、抗SARS、HIV病毒特性，其原因为抑制SARS病毒前S蛋白的活性，从而阻止其进入宿主细胞。LT用于治疗COPD、支气管哮喘、慢性咽炎以及变应性鼻炎等引起的慢性咳嗽。LT是一种具有抗炎作用的天然黄酮类化合物，具有抗炎和自由基清除作用5，目前研究发现LT能
13、减轻过敏性小鼠支气管收缩和气道高反应性调节，但对LT通过TLR4相关途径的哮喘尚无研究。因此，本研究探讨木犀草素是否可以通过抑制TLR4/NF-B途径诱导抑制哮喘模型的炎症。1实验材料1.1实验动物选择 SPF 级 SD 雌性幼年小鼠 40 只，4 周龄，体重（10020）g。广东省实验动物中心提供，饲养深圳大学SPF动物房。1.2主要试剂和仪器木犀草素（中国MCE公司），卵清蛋白（哈尔滨百杰斯生物公司），大鼠血清IL-2、IL-4 ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究所），RevertAid First Strand Cdna美国赛默飞世尔科技（中国）有限公司，PowerUp SYBRTM
14、Green Master MIX 美国赛默飞世尔科技（中国）有限公司，兔抗大鼠TLR4抗体（美国abcam公司），兔抗大鼠NF-B p65抗体（美国abcam公司），兔抗大鼠GAPDH抗体（美国abcam公司），HRP-羊抗兔IgG抗体（美国abcam公司），超声雾化器（江苏鱼跃医疗设备有限公司）。2实验方法2.1哮喘造模将幼年小鼠适应性饲养3 d之后，除去正常组幼鼠10只，剩余30只幼鼠在第1 d、7 d腹腔注射卵清蛋白和氢氧化铝预混制备的乳化液共1 mL（100 mg氢氧化铝和1 mg卵清蛋白）。第15 d、16 d、17 d、18 d、19 d分别给予雾化吸入含3%OVA的生理盐水 20
15、 min，正常组以及生理盐水代替卵清蛋白进行腹腔注射及雾化吸入。2.2药物干预OVA干预造模小鼠组随机分为3组，分别是哮喘模型组、LT低浓度组、LT高浓度组，每组10只小鼠。LT低浓度组、LT高浓度组均从第1次哮喘激发开始（造模第15 d），每只每天分别予1 mg/kg，2 mg/kg腹腔注射，以上各组连续给药14 d后，然后把小鼠处死进行实验研究。2.3实验标本采集第30 d，进行幼鼠眼眶取血，静置15 min后，4，3 000 r/min，离心10 min，取上层血清，保存于-80 冰箱中；开胸取出左上肺组织，冷冻于液氮中；取出右上肺组织，放入4%多聚甲醛固定。2.4小鼠气道高反应检测采用
16、小鼠无创肺功能仪检测小鼠气道高反应情况，按照肺功能仪检测步骤，使用不同剂量（0 g/mL、6.25 g/mL、12.50 g/mL、25.00 g/mL、50.00 g/mL、100.00 g/mL）乙酰甲胆碱激发后，检测各组小鼠气道高反应。2.5血清IL-2、IL-4含量测定取冻存的血清，采用ELISA方法检测各组大鼠血清IL-2、IL-4的浓度，具体实验方法根据ELISA试剂盒说明书操作，绘制标准曲线，计算IL-2、L-4浓度。2.6肺组织病理切片炎症观察将右上肺从4%多聚甲醛中取出，进行常规脱水，石蜡包埋，切片，苏木精伊红染色，封片，显微镜下观察肺组织炎症情况。2.7肺组织TLR4、NF-bpP65的RNA表达从NCBI库查找大鼠TLR4、NF-B 基因，根据基因设计TLR4、NF-B，取每组左上肺组织，放入液氮中充分研磨，按照 RNA 提取试剂盒说明书，提取 RNA。测量RNA浓度，根据RevertAid First Strand cDNA试剂盒，转录成 CDNA；根据 PowerUp SYBRTM Green Master MIX 试剂盒操作步骤，上机检测TLR4、NF-B的
