1、 509 CHINESE JOURNAL OF ANATOMY Vol.45 No.6 2022 解剖学杂志 2022 年第 45 卷第 6 期木犀草素通过减少心肌细胞凋亡和自噬减轻缺血再灌注大鼠心肌损伤赵思宇 邵 珣（舟山市岱山县中医院药剂科，舟山 316200）摘要 目的：目的：观察木犀草素（Lut）对大鼠心肌缺血再灌注（IR）损伤的作用，并探讨其可能机制。方法：方法：雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组（Sham组）、IR组和木犀草素组（Lut组）。缺血再灌注120 min后，检测血浆白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1（IL-1）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘
2、肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）和心肌肌钙蛋白T（cTnT）的表达水平。二氢乙锭（DHE）检测活性氧（ROS），末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）法检测心肌细胞凋亡，电镜观察自噬小体。免疫印迹检测Bax、Bcl-2、裂解caspase-9、AKT、p-AKT、STAT3、p-STAT3、LC3、p62、mTOR和p-mTOR的蛋白表达。结果：结果：木犀草素可显著降低IR后血浆IL-1、IL-6、MDA、CK-MB和cTnT水平，上调SOD和GSH-Px水平。此外，木犀草素可降低IR诱导的ROS累积、心肌细胞凋亡和自噬，并在IR过程
3、中激活了AKT、STAT3和mTOR信号通路。结论：结论：木犀草素可能通过抑制氧化损伤、细胞凋亡和自噬而在IR中起到心脏保护作用，其可能机制是通过激活AKT/mTOR/STAT3信号通路。关键词 木犀草素；心肌；心肌损伤；细胞凋亡；自噬；缺血再灌注；大鼠Luteolin reduces myocardial injury in rats with ischemia-reperfusion by reducing myocardial cell apoptosis and autophagyZhao Siyu，Shao Xun（Department of Pharmacy，Daishan Cou
4、nty Hospital of Traditional Chinese Medicine，Zhoushan 316200，China）Abstract Objective：To observe the effect of Luteolin（Lut）on myocardial ischemia-reperfusion（IR）injury in rats and explore its possible mechanism.Methods：Male Sprague-Dawley rats were randomly divided into a sham operation（Sham）group，
5、an IR group，and a Luteolin（Lut）group.After 120 minutes of ischemia-reperfusion，plasma interleukin-6（IL-6），interleukin-1（IL-1），superoxide dismutase（SOD），and glutathione peroxidase（GSH-Px），malondialdehyde（MDA），creatine kinase isoenzyme（CK-MB），and cardiac troponin T（cTnT）expression levels were detected
6、.Dihydroethidium（DHE）was used to detect reactive oxygen species（ROS），terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling（TUNEL）method was used to detect cardiomyocyte apoptosis，and electron microscopy was used to observe autophagosomes.Western blotting was used to detect the protein express
7、ion of Bax，Bcl-2，cleaved caspase-9，AKT，p-AKT，STAT3，p-STAT3，LC3，p62，mTOR and p-mTOR.Results：Luteolin significantly reduced plasma IL-1，IL-6，MDA，CK-MB and cTnT levels after IR，and increased SOD and GSH-Px levels.In addition，Lut reduces IR-induced ROS accumulation，cardiomyocyte apoptosis and autophagy，
8、and activates AKT，STAT3 and mTOR signaling pathways during IR.Conclusion：Luteolin has a cardioprotective effect during IR by inhibiting oxidative damage，apoptosis and autophagy.The possible mechanism is through activation of the AKT/mTOR/STAT3 signaling pathway.Key words luteolin；myocardium；myocardi
9、al injury；apoptosis；autophagy；ischemia-reperfusion；ratdoi：10.3969/j.issn.1001-1633.2022.06.004论 著第 1 作者 E-mail：收稿日期：2021-08-03；修回日期：2022-08-15缺血性心脏病早期及时再灌注是改善患者临床结局的有效方法1。心肌再灌注通过血管成形术或溶栓治疗迅速恢复血液供应，但会导致继发性级联损伤，即缺血再灌注（ischemia-reperfusion，IR）损伤，从而加剧缺血性损伤，并进一步扩大梗死面积2。心肌IR损伤的发病机制涉及多个分子过程，例如活性氧（reactive
10、oxygen species，ROS）积累和炎症细胞因子流入等。现代医学对于IR的干预方法包括缺血后适应和药物治疗，虽然对IR有不同程度的保护作用，但效果并不理想3。近年来，中医药在IR领域取得了一定的成果4-5，成为了中 510 西医结合研究的切入点之一。木犀草素（Luteolin，Lut）是从多种天然药材和果蔬中分离得到的黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和抗病毒等多种药理活性。研究表明，木犀草素能降低冠心病患者的死亡率，抑制糖尿病心肌病的心肌损害，并对心血管有保护作用6。然而，木犀草素在心肌IR中的保护作用机制尚未完全阐明，故本研究观察木犀草素对大鼠心肌IR损伤的作用，并探讨其可能机
11、制。1 材料和方法1.1 动物与试剂1.1 动物与试剂健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，约12周龄，450500 g，由温州医科大学动物实验中心（SYXK（浙）2018-0017）提供。所有动物被饲养在恒温（222）、湿度（45%5%）、昼夜周期为12 h的笼子里，并随机给予标准的啮齿动物食物和水。木犀草素（纯度98）、戊巴比妥钠购自Sigma-Aldrich，木犀草素溶解在二甲亚砜（DMSO）中后，用PBS稀释。所有生化指标试剂盒购买于南京建成生物工程研究所。血浆白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1（IL-1）和心肌肌钙蛋白T（cTnT）大鼠特异性酶联免疫吸附测定试剂盒
12、购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。LC3、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、p-STAT3、STAT3、Bax抗体购自Cell Signal Technology，p62、Bcl-2和caspase-9抗 体 购 自Abcam，TUNEL试 剂盒购自南京凯基生物公司。1.2 动物模型建立及分组1.2 动物模型建立及分组将18只大鼠随机分为假手术（Sham）组、模型组（IR组）和木犀草素组（Lut组），每组6只。Lut组大鼠在IR前每天经胃灌服木犀草素溶液20 mg/kg，连续7 d，Sham组和IR组大鼠在IR前每天经胃灌服等量溶剂7 d。第8天，大鼠术前禁食12 h，腹膜注射3
13、%戊巴比妥钠麻醉，仰卧固定在手术台上，连接四肢皮下心电图，监测动物心电图，剪断颈部毛皮，暴露气管，插管，连接小动物呼吸机（呼吸频率4560次/分）。在胸骨左侧23 cm处切开皮肤，肌肉分别钝性分离，左侧切断第35根肋骨，暴露心。左冠状动脉前降支位于左心耳，在前降支下方约12 mm处插针，拔出第30根缝线，Sham组只穿线不结扎150 min。IR组同Sham组，用30丝线穿入冠状动脉左前降支，在左冠状动脉前降支上放置一根长约1.0 cm的聚乙烯塑料细管结扎。心电图显示导联ST段抬高，动脉闭塞下心肌呈紫色。30 min后切断缝线，开放血管，恢复供血（再灌注）120 min。造模过程中，结扎30
14、min，导联ST段抬高，再灌注120 min心电图显示II导联部分压低，部分心肌由紫色变为暗红色，造模成功。Lut组手术方式与模型组相同。所有实验动物测量左心室相关指标：左室收缩末期压（LVSP）、左 室 舒 张 末 期 压（LVEDP）、+dp/dt max、dp/dt max。1.3 血浆促炎细胞因子及心肌损伤标志物检测1.3 血浆促炎细胞因子及心肌损伤标志物检测血浆IL-6、IL-1和cTnT的水平按市售大鼠特异性酶联免疫吸附测定试剂盒的说明进行分析。血浆肌酸激酶同工酶（CK-MB）采用全自动分析仪检测。血浆超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）按
15、南京建成生物工程研究所比色试剂盒检测说明书测定。1.4 心肌组织活性氧（ROS）检测1.4 心肌组织活性氧（ROS）检测二氢乙锭（dihydroethidium，DHE）用于测定ROS的产生。将不同组未固定组织的玻片与DHE（10 mol/L）在磷酸盐缓冲液（PBS）中室温孵育30 min。然后，对载玻片进行清洗、固定、安装，并进行荧光显微镜分析。1.5 心肌组织凋亡检测及透射电子显微镜分析1.5 心肌组织凋亡检测及透射电子显微镜分析心组织固定在4%多聚甲醛中，石蜡包埋，5 m厚切片，根据试剂盒说明采用TUNEL法检测心肌组织细胞凋亡。TUNEL阳性细胞核百分比=TUNEL阳性核数/总核数10
16、0。心组织样本固定，梯度乙醇脱水，1 m切片，柠檬酸铅和乙酸铀染色后，用日立透射电子显微镜（HT7700）观察切片。1.6 免疫印迹检测1.6 免疫印迹检测用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液从心肌组织中分离蛋白质，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。使用一抗LC3、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、p-STAT3、STAT3、Bax、p62、Bcl-2和caspase-9孵育过夜。随后，将膜与HRP偶联二抗在室温下孵育1 h，使用增强的化学发光法检测蛋白质条带。GAPDH作为内参，用Image J软件量化各条带，目的条带与内参条带比值为各蛋白表达量。1.7 统计学处理1.7 统计学处理使用SPSS 20.0进行统计学分析。符合正态分布的资料以xs表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，然后进行Tukeys检验。P0.05为差异有统计学意义。511 2 结果2.1 木犀草素预处理对缺血再灌注大鼠炎症反应和2.1 木犀草素预处理对缺血再灌注大鼠炎症反应和心肌损伤的影响心肌损伤的影响所有大鼠均在手术过程中存活。
