1、西 北 农 业 学 报 2 0 2 3,3 2(3):4 4 0-4 4 9A c t aA g r i c u l t u r a eB o r e a l i-o c c i d e n t a l i sS i n i c ad o i:1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 4-1 3 8 9.2 0 2 3.0 3.0 1 2h t t p s:/d o i.o r g/1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 4-1 3 8 9.2 0 2 3.0 3.0 1 2苹果树腐烂病生防链霉菌A 1 4 4的鉴定及其代谢产物的抑菌活性收稿日期:2 0 2 2-
2、0 1-2 0 修回日期:2 0 2 2-0 2-2 1基金项目:新疆维吾尔自治区重点实验室开放课题(2 0 2 0 D 0 4 0 3 2);国家重点研发计划(2 0 2 0 Y F C 1 8 0 6 6 0 3);新疆农业科学院农业科技创新平台能力提升建设专项(n k y p t 0 0 5)。第一作者:王 宁,女,硕士,研究实习员,研究方向为微生物天然产物挖掘。E-m a i l:1 0 0 7 4 0 7 8 7 2q q.c o m通信作者:张丽娟,女,硕士,副研究员,研究方向为微生物天然产物挖掘。E-m a i l:5 3 2 1 7 2 0 1 1q q.c o m王 玮,女,
3、博士,研究员,研究方向为微生物资源与应用。E-m a i l:w a n g w e i x 7 3x a a s.a c.c n王 宁,黄 伟,鲁致远,罗 义,马昊翔,张丽娟,王 玮(新疆农业科学院 微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室,乌鲁木齐 8 3 0 0 9 1)摘 要 旨在明确菌株A 1 4 4的分类地位及其代谢产物的抑菌活性。基于形态学观察、生理生化特征以及1 6 Sr D NA序列分析将菌株A 1 4 4鉴定为娄彻氏链霉菌(S t r e p t o m y c e sr o c h e i)。采用含药平板法测定菌株A 1 4 4的抑菌谱,结果表明其发酵滤液对苹果树腐烂病
4、菌(V a l s am a l iv a r.m a l i)、西瓜枯萎病菌(F u s a r i u mo x y s p o r u m)、水稻恶苗病菌(F u s a r i u m m o n i l i f o r m e)以及番茄早疫病菌(A l t e r n a r i as o l a n i)均有抑菌活性,抑菌率分别为6 8.1 5%2.6 2%、2 8.9 0%1.7 9%、3 3.7 7%2.5 9%和1 1.4 3%0.8 1%。以苹果树腐烂病菌为指示菌,从1 2种不同培养基中筛选出I S P 2培养基为菌株A 1 4 4的最佳发酵培养基,其发酵滤液的抑菌率达8
5、5.0 6%0.8 6%。平板涂抹法和平板对扣法试验结果表明,其脂肽粗提物、蛋白粗提物和挥发性物质对苹果树腐烂病菌均有抑菌活性,抑菌率分别为8 1.4 4%0.9 2%、4 7.9 2%2.2 5%和2 2.8 7%4.4 0%。可见,菌株A 1 4 4在苹果树腐烂病的生物防治中具有良好的开发潜力。关键词 娄彻氏链霉菌;苹果树腐烂病菌;代谢产物;抑菌活性 苹果树腐烂病(A p p l e t r e ev a l s ac a n c e r)是由壳囊孢(V a l s am a l iv a r.m a l i)侵染引起的一种真菌性病害,主要造成树皮、树干、枝条腐烂,导致树势衰弱、苹果品质和
6、产量下降,严重时可致整棵树枯死1-2。目前该病的防治主要通过化学农药,但长期使用化学农药不仅会使病原菌产生抗药性,还会产生环境污染和农药残留等问题,对人类健康造成潜在威胁3-4。因此,利用生物防治植物病害成为当前的研究热点,特别是利用微生物防治植物病害越来越受到人们的重视。放线菌是一类具有重要经济价值的微生物资源,从微生物中发现的生物活性物质约7 0%由其所产生,其中约5 0%来自链霉菌5-6。利用链霉菌产生的次级代谢产物进行植物病害的防治,因其具有高效、低毒无污染、不易使病原菌产生抗药性等特点,更符合现代农业的绿色可持续发展思路7-9。链霉菌能产生多种具有生物活性的次级代谢产物,包括脂肽类抗
7、生素、挥发性物质和抗菌蛋白(如细胞壁降解酶:几丁质酶、蛋白酶和纤维素酶等)1 0-1 1,在植物病害的生物防治方面具有巨大的应用价值。目前已有较多学者对这方面进行了相关研究,L i等1 2筛选获得了一株链霉菌,经鉴定命名为杨凌糖丝菌,其发酵液对苹果树腐烂病菌具有明显的抑菌作用,抑菌带宽度达2 0.2mm。P r a b a v a t h y等1 3从链霉菌PM S的代谢产物中分离出脂肽类化合物S PM 5 C-1,浓度为2 5g/m L时完全抑制稻瘟病和水稻纹枯病的生长。基于此,本研究通过形态学观察、生理生化特征以及1 6 Sr D NA序列分析确定菌株A 1 4 4的分类地位,并研究了菌株
8、A 1 4 4的发酵滤液、脂肽粗提物、蛋白粗提物以及挥发性物质对苹果树腐烂病菌的抑制效果,旨在为今后苹果树腐烂病的生物防治提供菌株资源和理论依据。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 供试菌株 菌株A 1 4 4由新疆农业科学院微生物应用研究所耐辐射微生物资源库保藏。植物病原真菌:马铃薯黑痣病菌(R h i z o c t o-n i a s o l a n i)、西 瓜 枯 萎 病 菌(F u s a r i u m o x y s p o-r u m)、水稻恶苗病菌(F u s a r i u m m o n i l i f o r m e)、棉花枯萎病菌(F u s a r i u
9、mo x y s p o r u m)、番茄早疫病菌(A l t e r n a r i a s o l a n i)、苹果树腐烂病菌(V a l s am a i lv a r.m a i l)由 中 国 农 业 大 学 李 健 强 教 授赠予。1.1.2 培养基 高氏一号培养基、P D A培养基、P D B培养基、L B培养基、T S B培养基、MR S肉汤培养基、I S P 4培养基均购自海博生物技术有限公司。海生菌肉汤2 2 1 6 E培养基购自美国B D公司。I S P 2培养基、I S P 3培养基按参考文献1 4配置,大米浸液、小米浸液和小米浸液培养基按参考文献1 5 配置。1.
10、1.3 主要试剂与仪器 供试试剂:细菌基因组D NA提取试剂盒,甲醇,盐酸,硫酸铵,磷酸盐缓冲剂,0.2 2m微孔滤膜均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。供试仪器:超净工作台(浙江孚夏,型号SW-C J-1 F),气浴振荡培 养箱(上海 天呈,型号T S-2 1 0 2 C),高 压 蒸 汽 灭 菌 锅(上 海 申 安,型 号L D ZM-6 0 K G S-),旋转蒸发仪(B u c h i,型号R-3 0 0),扫描电镜(日本电子,型号J EM-1 2 3 0 HC),全自动菌落分析仪(泽析生物,型号Z X-4 0 0),正置荧光数码显微镜(N i k o n,型号C i-L)。1.2
11、 菌株A 1 4 4的鉴定1.2.1 形态学观察 将斜面保藏的菌株A 1 4 4接种至I S P 4固体培养基上,于3 0培养57d观察菌株生长状态,挑取菌丝进行革兰氏染色,记录菌落颜色形态、气生菌丝颜色、基内菌丝颜色以及可溶性色素的有无。采用插片法在显微镜和扫描电镜下观察菌丝、孢子形态。1.2.2 生理生化特征 参照 链霉菌鉴 定手册1 6和 放线菌快速鉴定和系统分类1 7中的方法进行生理生化指标的测定。1.2.3 1 6 Sr D NA序列测定 挑取菌株A 1 4 4的单菌落接种于1 0 0m L/2 5 0m L三角瓶的I S P 4液体培 养 基,3 0、1 6 0r/m i n培 养
12、3d,1 00 0 0r/m i n离心1m i n收集菌丝体,液氮速冻后研磨,用细菌基因组提取试剂盒提取基因组。菌株的1 6 Sr D NA序列测定选择通用引物2 7 F和1 4 9 2 R进行 扩 增 测 序,引 物 序 列2 7 F:5 -AGAG T T T-GAT C C T G G C T C AG-3;1 4 9 2 R:5 -T A C C T T-G T T A C GA C T T-3。P C R扩增采用3 0L扩增体系(模板D NA2L,上下游引物各1L,M i x1 5L,d d H2O1 1L),扩增程序:9 4 预变性4m i n;9 4变性3 0s,5 4退火4
13、0s,7 2延伸9 0s,3 0个循环;7 2 延伸1 0m i n。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测,目标条带经切胶回收后委托北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司测序。测序结果在N C B I数据库上进行B L A S T比对,通过ME GA 7.0软件采用邻接法(N e i g h b o r-J o i n-i n g)构建系统发育树,B o o t s t r a p值设为10 0 0,确定菌株A 1 4 4的分类地位。1.3 菌株A 1 4 4抑菌谱的测定挑取菌株A 1 4 4的单菌落接种于5 0m L/1 0 0m L三角瓶的2 2 1 6 E液体培养基中,3 0、1 6 0r/m i
14、 n震荡培养3d作为种子液。将种子液接种于新鲜的2 2 1 6 E液体培养基中,发酵条件为接种量2%、装液量1 0 0m L/2 5 0m L三角瓶、发酵温度3 0、转速1 6 0r/m i n、培养时间1 4d,即得到菌株A 1 4 4的发酵液。将发酵液在4高速冷冻离心机中,1 00 0 0r/m i n离心1 0m i n,收集上清,过0.2 2m微孔滤膜得到无菌发酵滤液。采用含药平板法1 8检测无菌发酵滤液的抑菌活性。将无菌发酵滤液与冷却至5 0 左右的P D A培养基以体积比11 0混合倒板,制成含发酵滤液的P D A平板。在含药平板中心接种直径为5mm的供试真菌菌饼,以不含发酵滤液的
15、平板作为对照,3 0 培养5d,测量病原菌菌落直径,计算抑菌率,所有试验均设置3个重复。抑菌率=(对照组病原真菌菌落直径-处理组病原真菌菌落直径)/对照组病原真菌菌落直径1 0 0%1.4 菌株A 1 4 4代谢产物的抑菌活性1.4.1 菌株A 1 4 4不同培养基发酵滤液对苹果树腐烂病菌的抑菌活性测定 将菌株A 1 4 4的种子液 以2%的 接 种 量,接 种 于 不 同 培 养 基 中,3 0、1 6 0r/m i n震荡培养1 4d。按照“1.3”中的方法 收集无菌发 酵滤液并制 成含发酵滤 液的P D A平板。以苹果树腐烂病病原菌为指示菌,将直径为5mm的菌饼接种于含药平板中央,以不含
16、发酵滤液的P D A平板作为对照,每组3个重复,3 0 培养5d,测量病原菌菌落直径,根据“1.3”中的公式计算抑菌率,筛选菌株A 1 4 4最佳发酵培养基。1.4.2 菌株A 1 4 4脂肽粗提物对苹果树腐烂病菌的抑菌活性测定 按照“1.3”中的方法收集菌1443期王 宁等:苹果树腐烂病生防链霉菌A 1 4 4的鉴定及其代谢产物的抑菌活性株A 1 4 4的I S P 2培养基无菌发酵滤液,采用酸沉淀法提取脂肽,使用6.0m o l/L的盐酸调节p H至2.0,4静置过夜,4、1 00 0 0r/m i n离心3 0m i n后收集沉淀,用等体积1 0 0%甲醇萃取23次,合并萃取液,然后在旋转蒸发仪中减压浓缩得到脂肽提取物1 9。用无水甲醇溶解,分别配制成浓度为1m g/m L、1 0m g/m L、5 0m g/m L的脂肽粗提物溶液,并置于4冰箱保存,备用。采用平板涂抹法2 0检测脂肽粗提物的抑菌效果。取1 0 0L不同浓度的菌株A 1 4 4脂肽粗提物均匀涂抹于P D A平板上,然后将苹果树腐烂病病原菌接种于P D A平板中央,以未涂抹脂肽类粗提物的P D A平板为对照,每组3
