1、养禽与禽病防治2022 年第 8 期禽坦布苏病毒 NS5蛋白结构与功能研究进展汪威1汪婷2彭勇刚2殷世彬1徐欢1徐静1江心月1汪招雄1*（1.长江大学动物科学学院，湖北荆州4340252.荆州市江陵县农业农村局，湖北荆州434100）摘要：禽坦布苏病毒 NS5 蛋白是其组成中最为保守的非结构蛋白，目前关于禽坦布苏病毒的 E 蛋白和 NS1 蛋白的生物学特性研究较为普遍，而关于 NS5 蛋白的研究较少。本文就坦布苏病毒的 NS5 蛋白结构特点、相关生物学功能进行阐述，展望该蛋白的研究前景，另外采用生物信息学方法对 NS5 蛋白进行分析。开展对坦布苏病毒 NS5 蛋白的研究，有助于了解禽坦布苏病毒
2、非结构蛋白的相关功能，对坦布苏病毒也有更深层次的认识。关键词：禽坦布苏病毒NS5 蛋白研究进展2010 年，在中国大陆的鸭群中暴发了坦布苏病毒病（Tembusu Virus,TMUV），随后发现该病毒宿主范围不断扩大，除了致倦库蚊和三带喙库蚊外，在鸡、鸭、鹅、鸽和麻雀等禽类中也可检测出该病毒，其中种禽感染后会引起出血性卵巢炎症，导致产蛋量急速下降，给养禽业带来了较大的经济损失1。坦布苏病毒属于黄病毒科，其中非结构蛋白 NS5 位于黄病毒基因组阅读框的末端，是病毒基因组编码的分子量最大的蛋白质，由 N-末端甲基转移酶（MTase）结构域和 C-末端 RNA依赖性 RNA聚合酶（RdRp）结构域组
3、成2-4。本文就坦布苏病毒的非结构蛋白 NS5 蛋白生物学功能研究进展进行综述，另外采用生物信息学方法对 NS5 蛋白进行分析，这为后期深入了解 NS5 蛋白的生物学功能奠基理论基础。1NS5 蛋白结构特征1.1NS5 蛋白结构域非结构蛋白 NS5 是由 MTase 结构域和RdRp 结构域组成。禽坦布苏病毒 NS5-MTase结构域的功能活性区位于 NS5 蛋白的氨基端，它在形成帽子结构过程中分别参加了 2 步甲基化，这对 RNA的复制至关重要5。在同为黄病毒的寨卡病毒中，MTase 首先是以 S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体对寨卡病毒帽子结构进行甲基化,再与 GTP、帽子结构类似物和 RNA 类
4、似物结合6。在宿主-病毒共同进化过程中，细胞依靠先天免疫系统来抑制病毒的入侵，而病毒则采用抑制免疫反应和维持感染的策略，有研究表明 NS5-MTase 结构域还可抑制 RIG-I 泛素化、IRF3 的激活和 IFN-的产生7。RdRp 结构域位于 NS5 蛋白 C 端的末端，普遍具有保守性，该结构域与病毒编码的一些蛋白酶以及宿主的细胞因子可以构成病毒的复制酶系统，负作者简介：汪威，男，硕士（1998-），研究方向预防兽医，E-mail:；通讯作者：汪招雄*，男，副教授（1977-），硕士生导师，预防兽医学传染病方向，E-mail:基金：广东省畜禽疫病防治研究重点实验室开放课题（YDWS1905
5、）；农业微生物国家重点实验室开放课题（AMLKF201910）资助。中图分类号：S855.3 文献标志码：A 文章编号：1008-3847（2022）08-0009-049-养禽与禽病防治2022 年第 8 期责病毒基因组的复制机制，作为复制酶系统中的核心成分，它在病毒的复制过程中发挥着重要的作用8-9。1.2NS5 蛋白二级结构、三级结构选取在 GenBank 上公布的坦布苏病毒毒株（登录号为 NC_015843.2）为研究对象，截取NS5 蛋白序列（编码区长 2 715bp）。采用 SOP-MA软件对 NS5 蛋白序列中存在-螺旋、-转角、无规则卷曲和延伸链等二级结构进行分析；采用 SWI
6、SS-MODEL 在线软件预测 NS5 蛋白的三级结构。结果表明（图 1），NS5 蛋白的-螺旋区集中在 33 个区段，占比 42.98%；无规则卷曲区集中在 46 个区段，占比 37.57%；延伸链集中在 31 个区段，占比 14.14%；-转角集中在 24 个区段，占比 5.3%，晶体结构由MTase 和 RdRp 结构域交替组成。1.3NS5 蛋白翻译后修饰位点采用在线软件 NetNGlyc 1.0 Server 分析NS5 蛋白糖基化位点；采用在线软件 NetPhos3.1 Server 分析蛋白的磷酸化位点。结果表明坦布苏病毒 NS5 蛋白有 3 个 N-糖基化位点（图2），分别位于
7、第 48 位（NVTG）、214 位（NSTH）和 228 位（NVTN）；NS5 蛋白共含有 77 个磷酸化位点（图 3），其中有 40 个丝氨酸磷酸化位点、29 个苏氨酸磷酸化位点和 8 个酪氨酸磷酸化位点。2NS5 蛋白的生物学功能2.1NS5 蛋白在病毒基因组复制中的作用NS5 蛋白可以促进甲基转移酶和 RNA 依赖性 RNA聚合酶的活性,主要负责病毒基因组图 1TMUV NS5 蛋白二级结构预测注：蓝色部分(-螺旋)；红色部分(延伸链)；绿色部分(-转角)；紫色部分(无规卷曲)图 2TMUV NS5 蛋白 N-糖基化位点预测注：Threshold-阈值(0.5)；potential-
8、潜在糖基化位点位置10-养禽与禽病防治2022 年第 8 期的复制和加帽过程。FajardoTeodoro等10分别在体外实验和细胞实验中证明了 NS5 蛋白可以抑制病毒基因组的翻译，他们主要通过使用高纯度的组分在体外重组翻译，结果发现这种翻译能够通过与 5 端复制启动子区域的结合来阻断病毒复制起始阶段。另外 NS5 蛋白还可与SLA蛋白相互作用来直接阻断病毒基因组的翻译11。NS5 蛋白作为 IFN-拮抗剂采用的机制不尽相同12。有研究13利用反向遗传学方法将突变的 NS5 蛋白基因导入到坦布苏病毒的基因组中，最终获得了 2 株嵌合病毒，结果发现 NS5基因的突变在不改变体外适合性的情况下能
9、够降低病毒的感染性。WANG H Z 等14基于坦布苏病毒的 E 蛋白和 NS5 蛋白基因设计 shRNA在非洲绿猴肾细胞中过表达病毒基因，结果对比发现 NS5 蛋白 shRNA能够显著抑制 RNA复制和感染性病毒的产生。2.2核定位作用大多黄病毒的 NS5 蛋白主要存在于细胞核中，但是它的所有功能都发生在细胞质中15。有研究16发现寨卡病毒 NS5 蛋白在有丝分裂过程中会从细胞核重新定位到中心体，而在其它有多余中心体的感染细胞中，NS5 蛋白本就在中心体内，这说明 NS5 蛋白和中心体之间也存在着潜在的联系。具体来说，NS5 蛋白能够通过CRM1 的出口从细胞核中游出，在细胞核和细胞质之间穿
10、梭，在感染病毒过程中，由于 CRM1的抑制，NS5 蛋白的大量核积累与病毒产生的动力学改变和抗病毒趋化因子白 IL-8 的诱导减少相对一致17。2.3NS5 蛋白抑制干扰素信号黄病毒 NS5 蛋白能够抑制 JAK/STAT信号诱导的一系列细胞因子以外的干扰素，包括白介素。由于 IFN-/的效力，病毒逃避这一途径对感染至关重要。在黄热病病毒感染期间，IFN-/刺激黄病毒 NS5 蛋白的多泛素化从而与 STAT2 结合来抑制干扰素刺激基因的转录18。I 型干扰素反应是抵抗病毒感染的第一道防线，在日本脑炎病毒中，非结构蛋白 NS5 的表 达 主 要 通 过 激 活 PTP 阻 断 IFN 刺 激 的
11、JAK/STAT信号19。3结语及展望坦布苏病毒病作为对养禽业危害较为严重的家禽传染病之一，给我国养殖业带来了较大的经济损失。NS5 蛋白是坦布苏病毒基因组编码的最大的蛋白，在调控宿主抗病毒反应的过程中也发挥着关键作用，为了进一步了解坦布苏病毒 NS5 蛋白的基本结构特征，本研究通过对 NS5 蛋白进行生物信息学分析，结果发现NS5 蛋白的二级结构-螺旋、延伸链、-折叠和无规则卷曲分别占比 42.98%、14.14%、5.3%和 37.57%；预测 NS5 蛋白中含有 3 个 N-糖基化位点、77 个磷酸化位点。对 NS5 蛋白进行生物信息学分析为后期深入研究坦布苏病毒NS5 蛋白提供了理论参
12、考。在坦布苏病毒的研图 3TMUV NS5 蛋白磷酸化位点预测注：Serine-丝氨酸；Threonine-苏氨酸;Tyrosine-酪氨酸；Threshold-阈值（0.5）11-养禽与禽病防治2022 年第 8 期究中，对 NS5 蛋白的生物学功能研究比较欠缺，所以后期我们需要进一步加深对坦布苏病毒 NS5 蛋白生物学特性的研究。参考文献1Luo X,Liu Y,Jia R,et al.Ultrastructure of duckTembusu virus observed by electron microscopywith negative stainingJ.Acta virolog
13、ica,2018,62(3):330-332.2罗晓宇,嵇辛勤,阮涌,等.鸭坦布苏病毒病的研究进展J.中国家禽,2021,43(11):88-94.3陈珍,沈意兴,陈翠腾,等.禽坦布苏病毒及其蛋白功能研究进展J.福建畜牧兽医,2021,43(04):18-22.4DUan Y P,Zeng M,Zhang W,et al.Expressionand purification ofthe truncated duck DTMUVNS5protein and the subcellular localization of NS5 invitroJ.Poultryscience,2019,98(7)
14、:2989-2996.5Stephane D,KristyJ S,Jill S,et al.2-Omethy-lation ofthe viral mRNA cap evades host restrictionby IFIT family member J.Nature:Internationalweeklyjournal ofscience,2010,468(7322):452-6.6Afaq S,Atiya A,Malik A,et al.Analysis ofmethyltransferase(MTase)domain from Zika virus(ZIKV)J.Bioinforma
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