1、 年 月第 卷第 期.，.，收稿日期 基金项目 国家自然科学基金项目（）；中国博士后科学基金项目（）通信作者刘大会，教授，研究方向为中药资源及生态农业，：；杜鸿志，副教授，研究方向为中药药理与中药资源开发利用，：作者简介 计荣盛，硕士研究生，：芹菜素与氧化苦参碱联合用药抑制非小细胞肺癌的作用及其机制研究计荣盛，王梓灵，吴婷，李舟媛，陈乐，邓欣然，卢山，杜鸿志，刘大会（湖北中医药大学 药学院 中药资源中心，湖北 武汉；湖北中医药大学 药物制剂研究中心，湖北 武汉；中国中医科学院 中药资源中心 道地药材国家重点实验室培育基地，北京）摘要 研究芹菜素、氧化苦参碱、芹菜素与氧化苦参碱联合给药（以下简称
2、“联合给药”）对非小细胞肺癌细胞系的增殖作用及其分子作用机制的影响。采用 法检测芹菜素、氧化苦参碱以及联合给药对非小细胞肺癌 与 细胞活力的影响；通过平板克隆实验考察芹菜素、氧化苦参碱以及联合给药后对非小细胞肺癌细胞克隆形成能力的影响；实验验证芹菜素、氧化苦参碱以及联合给药对非小细胞肺癌 细胞增殖率的影响；与 实验考察芹菜素、氧化苦参碱以及联合给药后对 与蛋白相对表达的影响；分子对接实验探究芹菜素、氧化苦参碱与、蛋白的直接作用能力与作用位点；利用 法检测芹菜素、氧化苦参碱以及联合给药对 下游信号通路相关蛋白表达水平的影响。结果发现，芹菜素、联合给药在、均能显著抑制人非小细胞肺癌 与 细胞的活力
3、并呈浓度依赖性；芹菜素、联合给药作用于 细胞可显著抑制非小细胞肺癌细胞的克隆形成能力；芹菜素以及联合给药后可显著抑制 的 与蛋白相对表达；芹菜素、氧化苦参碱与、蛋白有较强的结合作用；芹菜素、联合给药可显著下调非小细胞肺癌细胞 及其下游信号通路蛋白表达水平。联合给药能抑制非小细胞肺癌，且其作用机制可能与 及其下游信号通路相关。该研究为芹菜素与氧化苦参碱联合应用治疗非小细胞肺癌提供科学依据，对联合给药抗肿瘤作用机制的深入研究具有一定的参考意义。关键词 芹菜素；氧化苦参碱；人非小细胞肺癌；增殖；通路 ，（，；，；，）（），（），（）计荣盛等：芹菜素与氧化苦参碱联合用药抑制非小细胞肺癌的作用及其机制研
4、究 ，；：.肺癌作为最常见的癌症之一，分别占全球癌症发病率与病死率的.与.。肺癌主要分为小细胞肺癌与非小细胞肺癌（），其中非小细胞肺癌为肺癌的常见分型，占肺癌总数的 左右。表皮生长因子受体（，）抑制剂是非小细胞肺癌靶向治疗的里程碑之一，已研发出第一代 抑制剂吉非替尼，第二代 抑制剂阿法替尼，由于其耐药性第三代 抑制剂奥希替尼也被研发。然而，由于激酶抑制剂的原发性耐药与获得性耐药问题，第三代 抑制剂已无法满足临床需求，第四代抑制剂正在研发中。因此，同一激酶靶点，“更新换代”的抑制剂开发策略捉襟见肘。一方面，诸如紫杉醇、雷公藤红素、人参皂苷等中药或天然产物由于“多途径和多靶点”的抗肿瘤作用机制，对
5、于酪氨酸激酶抑制剂（，）耐药肿瘤的出色治疗效果已成为研究热点。另一方面，大量研究发现处于激酶下游的效应分子也可以成为有效的治疗靶点。本团队前期研究充分证实赖氨酸羟化酶（，）作为 下游的靶点，可作为 替代治疗靶点从而解决其耐药性。总之，中药或天然产物是治疗非小细胞肺癌的可靠途径。芹菜素（）为，三羟基黄酮（，），又称为芹黄素，是一种天然的类黄酮化合物，纯品为黄色晶体状粉末。芹菜素广泛存在于自然界各类蔬菜水果中，如芹菜、西兰花、大蒜、苹果、洋葱等，在芹菜中含量最高；且在天然药物的瑞香科、马鞭草科、唇形科、卷柏科等植物中也 有 分 布。氧 化 苦 参 碱 又 名 苦 参 素（），为豆科属植物苦参 或平
6、科植物广豆根 中分离出来的生物碱。目前，大量文献报道芹菜素与氧化苦参碱均具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、神经保护等药理作用，在临床药物开发与应用上具有广阔研究前景。研究发现，芹菜素对小细胞肺癌 细胞、非小细胞肺癌、细胞等具有广谱抑制作用。天然药物氧化苦参碱也被报道可通过抑制 信号从而抑制非小细胞肺癌、细胞的增殖生长。团队前期研究发现，芹菜素与氧化苦参碱具有协同抗炎的作用，具有应用开发价值。为了扩大芹菜素与氧化苦参碱的联合应用范围，本文拟考察它们对非小细胞肺癌的抗肿瘤作用，并探究其作用机制。因此，本文拟探究芹菜素、氧化苦参碱以及芹菜素与氧化苦参碱联合给药（以下简称“联合给药”）对非小细胞肺癌的抑制作用
7、及其潜在作用机制，以期为芹菜素与氧化苦参碱联合用药提供更充分的科学支撑。本文采用 法、平板克隆实验与 实验验证芹菜素、氧化苦参碱以及联合给药对非小细胞肺癌 与 细胞增殖能力的影响；采用 与 实验探究芹菜素、氧化苦参碱以及联合给药对 下游 靶点的基因与蛋白表达水平的影响；通过分子对接实验探究芹菜素、氧化苦参碱与、蛋白直接作用的强度，并通过 实验进一步探讨其抑制机制与 及其下游信号通路的相互作用。因 年 月第 卷第 期.，.，此，本文通过研究芹菜素、氧化苦参碱以及联合给药对非小细胞肺癌的抑制作用及其潜在作用机制，以期为天然药物抗肿瘤研发提供理论基础与新的思路与方向。材料.药品与试剂人非小细胞肺癌、
8、细胞购于中国科学院上海生命科学院细胞资源中心；芹菜素、氧化苦参碱和芹菜素与氧化苦参碱混合物由湖北中医药大学药物制剂中心卢山副教授课题组提供；根据前期研究芹菜素与氧化苦参碱在物质的量比 混合时药剂学特性最佳，本研究中提前混合均匀，以相对分子质量.的整体进行药物浓度计算；基础培养基（批号）购于美国 公司；胎牛血清（，批号）购于江苏 公司；.胰蛋白酶 酶（批号）购于上海碧云天生物技术有限公司；二甲基亚砜（，批 号）购于中国国药集团股份有限公司；试剂 盒 购 于 南 京 凯 基 生 物 有 限 公 司（批 号）；总 提取试剂（批号）购自天根公司；荧光定量试剂（批号）购自武汉 公司；（批号）、（批号）、
9、（批号）、（批 号）、（批 号）、（批号）、（批号）、（批号）、标记的羊抗鼠 兔（批号 ）均购于武汉 公司；飞 克 特 超 敏 发 光 液（批 号）购于大连美仑生物技术有限公司。.仪器培养箱（赛默飞科技有限公司，型号）；酶标仪（美国 公司，型号 ）；荧光倒置显微镜（日本 公司，型号）；多色荧光化学发光凝胶成像系统（美国 公司，型号）；仪（罗氏诊断产品有限公司，型号）。方法.细胞培养 人非小细胞肺癌、细胞使用 完全培养基（含 胎牛血清），并置于 、饱和湿度恒温培养箱中培养。.细胞增殖实验取生长状况良好且处于对数生长期的 与 细胞，每组设置 个平行孔，按照每孔.个、接种于 孔板中。细胞置于恒温培养
10、箱中培养 使其完全贴壁生长，然后将芹菜素、氧化苦参碱以及联合给药配制成不同浓度的含药无血清培养基（、）进行换液培养，每孔 含药培养基。于加药 后，用培养基配制 的 溶液，每孔 ，置于恒温培养箱中，继续孵育 后，在多功能酶标仪上 处测定吸光度（），并 计 算 细 胞 抑 制 率。细 胞 抑 制 率（对照孔实验孔）（对照孔空白孔）。.药物协同作用评价根据国际药学界公认的 值法评估芹菜素与氧化苦参碱体外是否具有联合作用。为芹菜素给药组抑制率，为氧化苦参碱给药组抑制率。.表示有协同作用。.平板克隆实验将 细胞以.个 的密度，每孔 接种于 孔板中，于恒温培养箱中培养 。弃去旧培养基，加入含药无血清培养基
11、（、芹菜素 、氧化苦参碱 、联合给药 ），于恒温培养箱中培养 ，每 换液给药 次。当显微镜下观察细胞集落中细胞数达到 个时，弃培养基，每孔加入 洗涤 次。弃洗涤液，每孔加入 中性多聚甲醛溶液固定细胞 。弃固定液，重复洗涤步骤后，每孔加入 结晶紫染液染色 。弃去染色液，每孔加入 蒸馏水润洗后，倒置 孔板干燥，对多余 个细胞的集落进行计数统计。.实验 将 细胞以.个 的密度，每孔 接种于 孔板中，于恒温培养箱中培养 。弃去旧培养基，加入含药无血清培养基（、芹菜素 、氧化苦参碱 、联合给药 ），于恒温培养箱中培养。弃旧培养基，加入含 的完全培养基，于培养箱中继续孵育 标记细胞。弃旧培养基，每孔加入
12、中性多聚甲醛溶液固定细胞 。弃固定液，用 配制的 溶液洗涤每孔细胞 遍。弃去洗涤液，用 配制的.溶液孵育细胞 以促渗。弃去促渗液，重复洗涤液步骤。避光计荣盛等：芹菜素与氧化苦参碱联合用药抑制非小细胞肺癌的作用及其机制研究准备 反应混合物，每孔加入.反应缓冲物室温避光孵育 。去除反应混合物，重复洗涤步骤后，每孔加入.配制的 染液（），避光摇床上孵育。洗涤后，避光于激光共聚焦显微镜下观察增殖细胞（绿色）和所有细胞细胞核，随机挑选视野合成图像分析后计算抑制率。.实验将 细胞以.个 的密度，每孔 接种于 孔板中，于恒温培养箱中培养 。弃去旧培养基，加入含药无血清培养基（、芹菜素 、氧化苦参碱 、联合给
13、药 ），于恒温培养箱中培养 。弃旧培养基，每孔加入含 裂解细胞，收集裂解液并按照总 提取试剂说明书操作提取，并使用 反转录试剂对目的基因反转录。对 基因进行 分析。上游引物序列为，下 游 引 物 序 列 为。.“化合物靶点”的分子对接实验 通过计算机生物学实验室（）数据库检索芹菜素与氧化苦参碱的。于 数据库中检索芹菜素与氧化苦参碱的 结构，并以口服生物利用度（，）及类药性（，）.为筛选指标，进一步筛选符合条件的化合物。酶与 酶的晶体结构分别从 蛋白数据库（）与 数据库中下载，再运用 软件对靶蛋白进行修饰，去除晶体结构内的配体与非蛋白分子，转换为 格式。运用 将 蛋白结构与天然小分子化合物进行分
14、子对接，考察芹菜素、氧化苦参碱与、结合能力的强弱。.实验 细胞接种于小皿中，置于恒温培养箱中培养 ，细胞贴壁生长后，弃培养基，芹菜素、氧化苦参碱以及联合给药处理 后（、芹菜素 、氧化苦参碱 、联合给药 ），加入 含蛋白酶抑制剂与磷酸化蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，提取细胞总蛋白。采用 法测定蛋白浓度后，加入上样缓冲液置于金属浴上 加热。吸取质量相同的蛋白样品（每孔 ）上样，凝胶电泳，恒流转膜 后，将 膜置于快速封闭液，室温封闭，漂洗 次，每次。条带置于 配制的 脱脂奶粉一抗中 孵育过夜，漂洗 次，每次 ，换二抗室温孵育 ，漂洗 次，每次 ，曝光 ，显影。条带置于膜再生液中洗膜 ，重复封闭及封闭后步
15、骤，重新孵育其他抗体。.统计学分析采用 .软件进行统计学处理分析，计量实验数据结果以?表示，各组间采用单因素方差分析比较，样本均数间采用 检验，.认为差异具有统计学意义。结果.芹菜素、氧化苦参碱以及联合给药对非小细胞肺癌细胞活性的影响用 法测定、浓度下芹菜素、氧化苦参碱以及联合给药对人非小细胞肺癌细胞系（与 细胞）活性的影响。芹菜素、联合给药均显著抑制 细胞与 细胞的生长且呈浓度依赖性（图）。与芹菜素、氧化苦参碱相比，联合给药对 细胞作用 后抑制效果最佳，其 为.（图）。结果证实，芹菜素、联合给药均能显著抑制 与 细胞的活力，其中联合给药药效显著优于单独给药。.芹菜素与氧化苦参碱联合抗非小细胞
16、肺癌的协同作用评价上述芹菜素、氧化苦参碱以及联合给药分别对非小细胞肺癌细胞的抑制作用，充分显示芹菜素与氧化苦参碱具有联合增效作用。结果表明，芹菜素与氧化苦参碱联用具有协同作用，其中对 细胞协同抗肿瘤效果显著（表）。.芹菜素、氧化苦参碱以及联合给药对非小细胞肺癌细胞克隆形成能力的影响与对照组相比，芹菜素、氧化苦参碱以及联合给药分别以、处理 细胞 后，芹菜素、联合给药处理后细胞克隆形成能力均显著下降（.）；其中，与单独给药相比，联合给药对 细胞克隆形成抑制效果更为显著（图）。.芹菜素、氧化苦参碱以及联合给药对非小细胞肺癌细胞增殖力的影响 是目前检测细胞增殖能力的精确实验，本研究通过 成像实验考察芹菜素、氧化苦参碱以及联合给药对非小细胞肺癌增 年 月第 卷第 期.，.，与对照组比较.，.，.；与联合给药组比较.，.，.（图、同）。图 芹菜素、氧化苦参碱以及联合给药对非小细胞肺癌细胞系活性的影响（?，），（?，）图 芹菜素、氧化苦参碱以及联合给药抑制非小细胞肺癌细胞系活力的（?，），（?，）表 芹菜素与氧化苦参碱对 与 细胞的联合作用 组别）细胞 细胞芹菜素（）氧化苦参碱（）.芹菜素（）氧化苦
