1、2023年 第4期广东化工第50卷 总第486期23全自动固相萃取仪高浓度全自动固相萃取仪高浓度氯霉素样品残留清洗程序的研究氯霉素样品残留清洗程序的研究肖健，谢承恩，洪海燕(广州市越秀区疾病预防控制中心，广东 广州510055)摘要本研究建立了一种适用于全自动固相萃取仪的高浓度氯霉素样本残留清洗程序。用高浓度氯霉素样本提取液上机进行固相萃取，分别用甲醇和水对进样通道、注射泵和柱塞杆三个部位进行不同体积的清洗，然后对不同清洗方法的氯霉素残留量测定结果用t检验、方差分析、SNK-q检验进行数据分析，得出最优溶剂和清洗程序。结果表明，水作为清洗溶剂清洗效果比甲醇好，Fotector-02HT全自动固
2、相萃取仪的主要残留部位为进样通道，当样品氯霉素含量为5000 g/kg时，依次使用15 mL水和10 mL甲醇清洗进样通道，10 mL水和10 mL甲醇清洗注射泵，10 mL水和10 mL甲醇清洗柱塞杆，氯霉素残留量为0.0771 g/kg，低于方法0.1 g/kg的检出限。该清洗程序清洗效果稳定，氯霉素残留量低，可满足高浓度氯霉素样品的残留清洗要求。关键词全自动固相萃取仪；氯霉素；清洗程序；超高效液相色谱-串联质谱中图分类号R155文献标识码A文章编号1007-1865(2023)04-0023-03The Study of Cleaning Procedures for Automated
3、 SolidPhase Extraction Contaminated by Samples WhichContaining High Concentrations of ChloramphenicolXiao Jian,Xie Chengen,Hong Haiyan(Guangzhou Yuexiu Center for Disease Control and Prevention,Guangzhou 510055,China)Abstract:To establish a cleaning procedures for automated solid phase extraction co
4、ntaminated by samples which containing high concentrations ofchloramphenicol.The extract solution of samples which containing high concentrations of chloramphenicol was solid phase extracted on instrument,then washedinjection channel,syringe pump and plunger rod by different volume of methanol and w
5、ater separately.The residual concentration of chloramphenicol was detectedand results were analyzed by t-test,ANOVA and SNK-q test to find out the best solvent and cleaning procedure.The cleaning effect of water is better than that ofmethanol.The main residual part of Fotector-02HT automated solid p
6、hase extraction was the injection channel.If a sample which contain 5000 g/kg ofchloramphenicol was solid phase extracted on instrument,washed the injection channel with 15 mL water and 10 mL methanol,washed the syringe pump with 10 mLwater and 10 mL methanol and washed the plunger rod with 10 mL wa
7、ter and 10 mL methanol in turn can reduce the residue to 0.0771 g/kg,which was lower thanthe detection limit of 0.1 g/kg.The cleaning effect of the cleaning procedure is stable and the chloramphenicol residue was low,it can meet the residual cleaningrequirements of samples which containing high conc
8、entrations of chloramphenicol.Keywords:automated solid phase extraction；chloramphenicol；cleaning procedures；ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry固相萃取法是基于液相色谱分离原理的样品前处理方法，可达到分离、净化和浓缩样品的目的，具有溶剂用量少，操作简便的优点，但是由于溶剂流速对固相萃取效率有很大影响，人工操作的固相萃取经常出现平行性差的问题1-2。氯霉素是世界上首种完全由合成方法大量制造的广谱抗生
9、素，对很多不同种类的微生物均起作用，但是，食品中残留的氯霉素会对人体健康造成威胁，如可逆性骨髓抑制、神经系统受损等3-4。近年来，随着设备自动化的发展，全自动固相萃取仪应运而生，它能够根据程序设置进行活化、上样、清洗、洗脱的实验步骤，通过正压或负压抽吸解决了溶剂流速不可控和不稳定的问题，保证了样品测定的平行性，同时可以实现无人值守下大批量样本的自动固相萃取，节省了时间，提高了效率5-6。然而，全自动固相萃取也存在容易发生样品污染的问题，有研究曾在水产品违禁添加物监测和养殖水检测中发现部分软体类样本氯霉素含量超过1000 g/kg7-9，如果样品目标物浓度较高，一般的清洗程序无法完全清楚仪器的污
10、染，会导致队列的后续样本被污染的问题。本实验以氯霉素为样本，在全自动固相萃取仪可能存在进样残留的部件(进样通道、柱塞杆，注射泵)进行清洗溶剂和清洗体积选择，以确定最佳的清洗程序。1材料与方法材料与方法1.1主要仪器与试剂Reeko Fotector-02HT全自动固相萃取仪美国睿科、WATERS AcQuity Xevo TQD超高效液相色谱-串联质谱仪美国沃特世、LabTech MV5氮吹仪、Milli-Q超纯水机、电子分析天平。氯霉素标准品(98.5%)和氯霉素D5标准溶液(100 ng/L)均购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH；甲醇、乙腈和乙酸乙酯均为质谱纯，无水硫酸钠和氨
11、水均为分析纯，试验用水为超纯水，固相萃取小柱(Poly-Sery HLB SPE Cartidge，60 mg 3 mL)购自上海安谱。1.2方法101.2.1标准溶液的配制标准储备溶液：将氯霉素标准品用乙腈溶解稀释，配置成100 mg/L的标准储备溶液。用乙腈稀释配成10 g/mL的标准中间储备溶液和100 g/L的标准使用溶液。内标使用液：将氯霉素D5标准溶液用乙腈稀释配制成100 g/L的内标使用液。1.2.2样本处理空白样本提取液：称取5 g空白样品，加入10 mL乙酸乙酯和0.3 mL氨水，5 g无水硫酸钠，然后加入0.6 mL氯霉素D5标准使用溶液，涡旋混匀，超声提取10 min，
12、高速离心，将上层转移到25 mL容量瓶中，残渣重复提取一次，合并两次溶液，用乙酸乙酯定容到25 mL，40氮吹至干，加入25 mL乙腈+水(1+10)溶解残渣。氯霉素加标样本提取液(5000 g/kg)：吸取氯霉素标准储备溶液100 L用空白样本提取液定容到5 mL。将氯霉素加标样本提取液放入全自动固相萃取仪进行固相萃取，弃去接收的洗脱溶液，然后放入空白样本提取液进行固相萃取，收集洗脱溶液，于35氮吹至干，加入1.0 mL 0.1%收稿日期2022-08-04基金项目越秀区科技计划项目(2019-WS-011)作者简介肖健(1984-)，男，广东汕头人，硕士，理化检验主管技师，主要研究方向为食
13、品安全与理化检验。广东化工2023年 第4期第50卷 总第486期乙酸水溶液+甲醇(88+12)溶解残渣，0.22 m微孔滤膜过滤后上机测定。1.2.3清洗溶剂和程序实验1.2.3.1清洗溶剂的选择将氯霉素加标样本提取液放入全自动固相萃取仪进行固相萃取，弃去接收的洗脱溶液，然后放入空白样本提取液进行固相萃取，分别用5 mL水和甲醇对进样通道、注射泵和柱塞杆进行清洗，用6 mL甲醇洗脱，收集固相萃取柱洗脱溶液，于35氮吹至干，加入1.0 mL 0.1%乙酸水溶液+甲醇(88+12)溶解残渣，0.22 m微孔滤膜过滤后上机测定。每个条件进行6次平行实验。通过清洗效果确定清洗溶剂。1.2.3.2清洗
14、体积的选择将氯霉素加标样本提取液放入全自动固相萃取仪进行固相萃取，弃去接收的洗脱溶液，然后放入空白样本提取液进行固相萃取，分别用5 mL、10 mL、15 mL、20 mL水对进样通道、注射泵和柱塞杆进行清洗后，用6mL甲醇洗脱，收集固相萃取柱洗脱溶液，于35氮吹至干，加入1.0 mL 0.1%乙酸水溶液+甲醇(88+12)溶解残渣，0.22 m微孔滤膜过滤后上机测定。每个条件进行6次平行实验。通过清洗效果确定清洗体积。1.2.4仪器条件色谱：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.150 mm，1.7 m)；柱温40；流速为0.4 mL/min；进样量为10 L。
15、流动相为A：0.1%乙酸水溶液，流动相B：甲醇。梯度洗脱程序见表1。表表1梯度洗脱程序梯度洗脱程序Tab.1Gradient elution program时间/min流动相A/%流动相B/%0.0088121.5030702.0088123.008812质谱：离子化模式：电喷雾电离负离子模式；质谱扫描方式：多反应监测；电喷雾电压：-4500 v，雾化器压力：0.276 MPa，气帘气压力：0.172 MPa，辅助器流速：0.206 MPa，离子源温度：550，定量离子对/定性离子对/碰撞气能量/去簇电压见表2。表表2氯霉素和氯霉素氯霉素和氯霉素-D5质谱参数质谱参数Tab.2Mass spe
16、ctrometric parameters for chloramphenicol and chloramphenicol-D5名称定量离子对(m/z)(母离子/子离子)定性离子对(m/z)(母离子/子离子)碰撞气能量去簇电压氯霉素330.9/151.9320.9/256.9320.9/151.9-25-16-72-73氯霉素-D5326.1/157.0326.1/262.0326.1/157.0-25-17-60-601.2.5统计学分析采用Excel软件进行数据录入，采用SPSS 19.0进行统计分析，对测定后的残留量用t检验、方差分析、SNK-q检验进行数据比较。2结果结果2.1清洗程序的建立Reeko Fotector-02HT全自动固相萃取仪是通过进样针和管路组成的进样通道将待净化样本液吸入仪器的注射泵中，再通过注射泵将溶液进行输送，通过柱塞杆加注到固相萃取柱中进行吸附和洗脱。因此，可能存在污染的部件为进样通道、注射泵和柱塞杆，故将这3个部件作为样品残留清洗的主要部件，开展清洗效果的实验。2.1.1清洗溶剂的选择氯霉素在水和甲醇中的溶解性较好，且毒性较低，因此，将水和甲醇作为
