1、2023 年 3 期智慧农业导刊Journal of Smart Agriculture现代农业手参愈伤组织培养及再生体系建立的研究进展宝音图1，包金花2，白永峰1，阿拉坦存布尔1，红霞1，奥 乌力吉3，王秀兰1，3，曹乌吉斯古楞1，4*（1.内蒙古民族大学 蒙医药学院，内蒙古 通辽 028000；2.内蒙古民族大学 农学院，内蒙古 通辽 028000；3.内蒙古蒙医药工程技术研究院，内蒙古 通辽 028000；4.蒙医药研发工程教育部重点实验室/内蒙古民族大学，内蒙古 通辽 028000）手参（Gymnadenia conopsea（L.）R.Br.），又称手掌参、佛手参和手儿参等，蒙药名额
2、日和藤乃一嘎日，异名旺拉嘎。属兰科多年生草本植物手参的块茎，本品味甘、涩，性重、腻、软、稀、钝、温。有益精壮阳，治遗精之功效。主治肾寒、腰腿酸痛、遗精、滑精、阳痿、巴木病、游痛症、陶赖、赫如虎和身体虚弱。生于林间草地、河谷及灌木丛中。分布于东北、华北、西北及四川、云南、西藏等地1-4。在自然环境中，手参主要靠分蘖方式繁殖，可操作性差，繁殖系数低；因发芽率低、种子休眠期长，通常不能通过种子繁殖。近年来，随着野生资源不断被采挖，数量日趋减少，远不能满足市场需求。目前手参已被 濒危野生动植物种国际贸易公约（CITES）附录（2013 版）列为级珍稀濒危植物5；被国家重点保护野生植物名录（1999 版
3、）列为国家级保护植物；被 中国物种红色名录（植物部分）评定为“濒危”级别。组织培养技术具有繁殖系数高、育种周期短和经济方便等优点6，无疑是解决手参资源稀缺问题的有效方法，对其种质资源保护和可持续利用具有重要意义。因此，通过在大量文献调研的基础上，对手参愈伤组织诱导及再生体系建立研究进展进行综述，以期为手参的合理利用和深度研究提供参考。1手参的种胚培养1.1胚龄和种子成熟度的筛选高晓玲等7选用 14 月胚龄的幼果经消毒处理后进行胚培养。结果发现 4 个月胚龄对于手参胚的萌发和成苗最为有利。丁兰等8选取绿色、饱满的未成熟果荚或未开裂的成熟果荚等 3 种不同阶段的种子，经消毒处理后，撒播在培养基上，
4、结果表明，成熟佛手参种子难以萌发，而未成熟种子具有萌发能力，萌发率可达到20%；Nabieva 等9也通过实验研究发现成熟的种子不具备萌发的能力，而未成熟的种子则能长成幼苗。1.2种胚消毒处理方法种胚消毒处理方法见表 1。基金项目：内蒙古自治区科技计划项目（2021GG0003）；内蒙古自治区高校中（蒙）药材生态种植研究中心（培育）项目（无编号）；内蒙古民族大学博士启动基金（BS509）；内蒙古民族大学2021年硕士研究生科研创新资助项目（NMDSS2108）第一作者简介：宝音图（1999-），男，硕士研究生。研究方向为蒙药资源和品种鉴定。*通信作者：曹乌吉斯古楞（1982-），女，博士，副教
5、授。研究方向为蒙药资源和品种鉴定。摘要：手参属于兰科的手参属植物，是一门名贵的蒙药材，亦是中医与藏医常用的药材。但因为其野生资源稀缺并且过度采挖，无法满足市场需求，组织培养技术具有繁殖系数高，育种周期短，经济方便等优点，故建立一套有效的手参组织培养技术以提高其经济价值是至关重要的。该文综述关于手参组织培养及再生体系建立等方面的研究进展，包括外植体的选择，培养基和激素的配置，以及在组培过程中会出现的污染与褐化等问题，以期为手参的深入研究提供参考依据。关键词：手参；外植体；消毒处理；组织培养；愈伤组织中图分类号：S4文献标志码：A文章编号：2096-9902（2023）03-0053-05Abst
6、ract:Gymnadenia conopsea belongs to the genus Gymnadenia Ginseng of Orchidaceae.It is a valuable Mongolianmedicine and a commonly used medicine in traditional Chinese medicine and Tibetan medicine.However,due to its scarcity of wildresources and over-mining,it cannot meet themarket demand.Thetissuec
7、ulturetechnologyhastheadvantagesofhighreproduction coefficient,short breeding cycle,economic convenience and so on.Therefore,it is very important to establish a set ofeffective tissue culture techniques of Gymnadenia conopsea to improve its economic value.This paper reviews the research progresson t
8、issue culture and the establishment of regeneration system of Gymnadenia conopsea,including the selection of explants,theconfiguration of culture medium and hormones,and the problems of pollution and browning in the process of tissue culture,in orderto provide a reference basis for the further study
9、 of Gymnadenia conopsea.Keywords:Gymnadenia conopsea;explants;disinfection treatment;tissue culture;callusDOI：10.20028/j.zhnydk.2023.03.01353-2023 年 3 期现代农业智慧农业导刊Journal of Smart Agriculture材料 步骤 参考文献 蒴果 擦拭表面灰尘,浸泡于 75%酒精 3min,用 10%NaC10 溶液消毒 30min,然后用无菌水冲洗 45 次 7 果荚 擦拭表面尘土,在流水下冲洗 30min,蒸馏水清洗 35 遍,无菌
10、水冲洗 3 遍后,先用 75%乙醇消毒 60120s,再用 0.1%HgC1?浸泡 1520min,最后用无菌水冲洗 57 遍 8 种子 流水冲洗 30min,然后浸入 2 滴 Tween-20 和 20%“Domestos”(当地的一种洗衣粉)的混合物中 10min。然后用 0.25%氯化汞(w/v)处理 8min,然后用 70%乙醇消毒 30s,用无菌蒸馏水冲洗 3 次 9 1.3种胚培养基高晓玲等7共选择了 MS、1/2MS、PT、N6、Kundson C和 G36 种常用的培养基进行了实验，发现在 G3 和 N6 培养基上的萌发率及成苗率较低，然而在 MS、1/2MS、Kundson
11、C 和 PT 培养基上手参的成苗率及萌发率相对较高。PT 培养基的成本相对较低，因此选择为最适合萌发培养基。以 PT 培养基为基本培养基试验添加 10%果蔬提取物和 1%活性炭，对手参胚的萌发率、萌发期、成苗率和成苗期 4 个参数进行观察。最后发现总体促进效果最佳的是添加 10%马铃薯提取物的培养基，在添加 1%活性炭后其主要的优势体现在成苗期缩短，与对照相比缩短了 5d。丁兰等8以 1/2MS 作为基础培养基，附加种类和浓度不同的植物生长物质，并添加 20g/L 蔗糖、200mL/L 椰汁、5.0g/L琼脂及 1.0g/L 活性炭，培养基 pH 调至 5.6。结果发现最适萌发培养基为 1/2
12、MS+1.02.0 mg/L KT+0.1 mg/L NAA+10.0 mg/L 腺嘌呤。Nabieva 等9选择 Kundson（Kn）、1/3MS和 Harvais（Har）3 种培养基培养种子，所有营养培养基都添加了 0.1 mg/L NAA、1.0 mg/L 2 异戊烯基腺嘌呤（2iP）和 10%椰子水，琼脂从 10 g/L 减少到 6 g/L，蔗糖从 30g/L减少到 10g/L，pH 调节至 5.6。种子在 24h 的暗光周期中发芽约 68 周后在 1/3MS 培养基中获得幼苗。2手参愈伤组织培养2.1外植体的选择植物组织培养过程中外植体的选取既是基础环节也是能否培育出合格幼苗的核
13、心步骤10。植物所有器官组织均具备成长为完整植株的能力，然而在不同组织中，其再生分化的能力存在差异11。李蒙飞等12将叶片、根尖、花梗、茎尖和腋芽作为外植体，结果不同外植体愈伤组织诱导率有差异，其中，以茎尖诱导率最高，且愈伤组织形成的平均天数也最短，为 12d；叶片、根尖无愈伤组织形成。彭克忠等13将茎尖、根尖和侧芽接种到愈伤组织诱导培养基上，结果根尖严重褐化，失去诱导愈伤组织的能力；且茎尖和侧芽上均产生愈伤组织，但其诱导率有差异。其中，诱导率最高的是茎尖外植体。顾地周等14通过体胚诱导实验表示手参茎尖较适宜胚性愈伤组织及胚性细胞复合体诱导。杨爽等15利用秋天采收的野生手掌参的腋芽展开了不同因
14、素对外植体褐变影响的实验。金洪等16选择块根、不定根、茎段、花序轴、子房、叶鞘、叶片和芽部作为外植体，唯一获得成功的外植体为芽部，笔者表示该部位实际是顶芽和缩短的茎。而其他外植体均先后褐变死亡，无明显分化迹象。2.2外植体消毒处理方法植物组织培养过程中，获得无菌外植体是组织培养成功的必要前提17，外植体带菌会直接导致污染现象发生18。因此，通过实验筛选出合适的消毒试剂及其时间组合，在尽量减少对外植体组织伤害的同时保持材料本身活力，在此情况下将附着于外植体表面的微生物完全消杀。当前在组织培养实验过程中常用的消毒试剂主要有升汞、乙醇和次氯酸钠等19。各种试剂的消毒效果和清洗的难易程度各有不同：乙醇
15、渗透性较强，但消毒作用十分有限；升汞的杀菌效果最强，但使用后难以清洗，易引起外植体褐化，且不利于环保；次氯酸钠消毒较温和，容易清除，对外植体伤害较小17。手参不同外植体消毒处理方法见表 2。2.3基本培养基与外源激素培养基是决定植物组织培养成功与否的主要因素之一17。植物生长调节剂可影响和有效调控植物的生长和发育，通常由人工合成的或从微生物中提取，其生理和生物学效应与植物激素类似，在组织培养中有着至关重要的作用18。2.3.1诱导培养基李蒙飞等12以 MS 作为基础培养基分别单独添加低浓度 NAA 和低浓度 2，4-D 或将低浓度 6-BA 与 NAA 和2，4-D 组合添加，所有培养基添加
16、20g/L 蔗糖、6g/L 琼脂和0.5g/L水解酪蛋白，pH调至5.8。发现MS+0.5 mg/LNAA的培养基愈伤组织诱导率最高，附加 1.0mg/L 2，4-D 的最低，并表示生长素和细胞分裂素组合添加时，愈伤组织诱导率要低于单独添加生长素。彭克忠等13以 MS 培养基为基础培养基，添加不同浓度的植物生长调节剂：单独添加2，4-D和NAA，浓度分别都是0.10、0.25、0.50、0.75和1.00mg/L；表1种胚消毒处理方法54-2023 年 3 期智慧农业导刊Journal of Smart Agriculture现代农业表2手参不同外植体消毒处理方法材料 步骤 参考文献 叶片、根尖、花梗、茎尖、腋芽 浸泡于饱和洗衣粉水溶液10 min,自来水冲洗1?h后转入无菌瓶。先后用75%酒精浸泡10 s和0.2%NaCl0消毒 5 min,无菌水摇洗 5 次;最后用 0.1%HgCL?消毒 5?min,无菌水摇洗 5 次,备用 12 茎尖、根尖、侧芽 浸泡于吐温10 min,自来水冲洗1 h后转入超净台进行切割消毒。先后用75%乙醇浸泡10?s和0.2%NaCl0消毒 5?min,
