1、中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2023，39（2）：233-240杂志网址：http:/视黄醇结合蛋白1通过激活TAK1促进大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大*谢菁，周艳丽，陈思思，王继春，江洪（武汉大学人民医院心血管内科，武汉大学心血管病研究所，心血管病湖北省重点实验室，湖北 武汉 430000）摘要 目的：探究视黄醇结合蛋白1（retinol binding protein 1，Rbp1）在大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大中的功能和机制。方法：本研究通过联合分析基因表达数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）中的小鼠心肌肥厚基
2、因芯片数据，寻找在心肌肥厚发生过程中的关键调控因子，构建该基因过表达及敲减腺病毒并感染大鼠乳鼠原代心肌细胞，利用血管紧张素II（angiotensin II，Ang II）诱导大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大模型，研究目的基因对大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大的影响，应用Western blot及RT-qPCR探究目的基因调控大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大的分子机制。结果：在小鼠心肌肥厚心脏组织中Rbp1的表达显著上调（P0.01），体外细胞实验显示与对照组相比，Rbp1过表达组的大鼠乳鼠原代心肌细胞面积显著增大，心肌肥厚标志基因心钠肽（atrial natriuretic peptide，Anp）和肌球蛋白重链7
3、（myosin heavy chain 7，Myh7）的表达显著升高（P0.01），证实Rbp1过表达能促进Ang II诱导的大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大；相反，Rbp1敲减则能显著抑制Ang II诱导的大鼠乳鼠原代心肌细胞面积增加和心肌肥厚标志物表达。机制研究显示，Rbp1过表达显著激活转化生长因子激活激酶1（transforming growth factor-activated kinase 1，TAK1）和P38（P0.01），应用TAK1抑制剂可阻断Rbp1过表达对Ang II诱导大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大的促进作用。结论：Rbp1可通过激活TAK1信号通路促进Ang II诱导的大鼠乳鼠原
4、代心肌细胞肥大。关键词 视黄醇结合蛋白1；大鼠乳鼠原代心肌细胞；心肌肥大；TAK1/P38信号通路中图分类号 R541.6；R363.2 文献标志码 A doi：10.3969/j.issn.1000-4718.2023.02.005Retinol binding protein 1 promotes hypertrophy of primary neonatal rat cardiomyocytes via activating TAK1XIE Jing，ZHOU Yanli，CHEN Sisi，WANG Jichun，JIANG Hong（Department of Cardiology，
5、Renmin Hospital of Wuhan University，Cardiovascular Research Institute，Wuhan University，Hubei Key Laboratory of Cardiology，Wuhan 430000，China.E-mail：）ABSTRACT AIM：To investigate of the function and mechanism of retinol binding protein 1（Rbp1）in the hypertrophy of primary neonatal rat cardiomyocytes.M
6、ETHODS：The microarray data from Gene Expression Omnibus（GEO）database was analyzed to identify the key regulatory factors in the process of cardiac hypertrophy.In order to explore the function of the key gene in the hypertrophy induced by angiotensin II（Ang II），overexpression and knockdown adenovirus
7、es were constructed to infect primary neonatal rat cardiomyocytes.Western blot and RT-qPCR were used to explore the mechanism of the key gene regulating hypertrophy of primary neonatal rat cardiomyocytes.RESULTS：The expression of Rbp1 was significantly up-regulated（P0.01）in the heart of mouse cardia
8、c hypertrophy models.Moreover，in vitro experiments showed that compared with control group，the area of primary neonatal rat cardiomyocytes and the expression of cardiac hypertrophy marker gene atrial natriuretic peptide（Anp）and myosin heavy chain 7（Myh7）was significantly increased in Rbp1 overexpres
9、sion group，indicating that overexpression of Rbp1 promotes Ang II-induced primary neonatal rat cardiomyocytes hypertrophy.On the contrary，knockdown of Rbp1 dramatically inhibited the increase in primary neonatal rat cardiomyocyte area and the expression of cardiac hypertrophy markers induced by Ang
10、II.Overexpression of Rbp1 activated transforming growth factor-activated kinase 1（TAK1）and its downstream target P38（P0.01）.Treatment with TAK1 inhibitor blocked the effect of Rbp1 overexpression on Ang II-induced primary neonatal rat cardiomyocyte 文章编号 1000-4718（2023）02-0233-08 收稿日期 2022-09-02 修回日期
11、 2022-12-19*基金项目 中央高校基本科研业务费专项资金青年教师资助项目（No.2042019kf0093）通讯作者 Tel：027-88041911；E-mail：233hypertrophy.CONCLUSION：The Rbp1 promotes Ang II-induced primary neonatal rat cardiomyocyte hypertrophy by activating the TAK1/P38 signaling pathway.KEY WORDS retinol binding protein 1；primary neonatal rat cardi
12、omyocytes；cardiomyocyte hypertrophy；TAK1/P38 signaling pathway心力衰竭是心室充盈和（或）射血功能受损，心脏排血量不能满足机体组织代谢需要的临床综合征，是临床上心肌肥厚等多种心血管疾病的最终结局1。心肌肥厚是心力衰竭发生发展的一个基本病理过程。众多基础研究提示，心肌肥厚是一个复杂的、众多基因和信号通路参与的病理过程2，且目前临床上缺乏有效药物。因此，阐明心肌肥厚发生发展的分子机制，寻找调节心肌肥厚的关键靶点具有重要意义。视黄醇结合蛋白（retinol binding protein，Rbp）是人体内视黄醇转运蛋白，主要帮助肝脏中视黄醇
13、的转移，并协助视黄醇进行代谢、存储、发挥作用，半衰期较短，能敏感的反映机体的疾病状态3。既往研究提示Rbp1可驱动维生素A为活性代谢产物全反视黄酸（all-trans-retinoic acid，ATRA），ATRA可调节细胞的增殖、凋亡、分化及迁移4-5。此外，Rbp1还参与生物体内多个生理过程如肥胖及血脂代谢异常等6，但Rbp1在心肌肥厚中的作用还未见报道。本项工作通过腺病毒感染大鼠乳鼠原代心肌细胞和PE 诱导的大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大模型，探讨Rbp1对大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大的影响。材料和方法1主要试剂BCA 蛋白试剂盒（Thermo Scientific）；PVDF 膜（Millip
14、ore）；抗 Rbp1 抗体（ABclonal）；抗 TAK1 单克隆抗体（Abcam）；p-P38 单克隆抗体、P38 多克隆抗体、p-TAK1单克隆抗体及GAPDH单克隆抗体（Cell Signaling Technology）；化学发光底物试剂（Bio-Rad）；Trizol总RNA提取试剂（Invitrogen）；cDNA转录合成试 剂 盒 和 SYBR Green PCR Master Mix（Roche）；DMEM/F12培养液（Gibco）；胎牛血清（Gibco）；抗辅肌动蛋白（-actinin）抗体（Merck Millipore）；TAK1抑制剂NG52（MedChemExp
15、ress）；其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯；所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。2主要方法2.1生物信息学分析借助R包GEOquery（Davis and Meltzer，2007）从美国国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）的GEO数据库下载对应数据集的原始数据及芯片探针对应的基因名称注释文件，随后使用R包寡核苷酸（Carvalho and Irizarry，2010）中 的 函 数（read.celfiles）读取芯片原始数据，并使用 RMA（Robust Multiarray Aver
16、age）算法对原始数据进行背景校正，使用分位数方法进行样本间的标准化，运用统计学方法将前面得到的荧光强度值从探针水平汇总到探针组水平，再将汇总后的数据转换为以2为底的对数，经过RMA函数运算得到标准化后的探针表达量矩阵，根据得到的注释文件，对探针组名称进行基因名称注释，最终得到基因的表达量矩阵。计算不同组别之间基因的表达差异，根据基因表达量差异，去除重复的基因，保留重复基因中差异最大的一个。使用t检验对不同组进行统计学检验，依据倍数多少和P值确定差异基因。2.2大鼠乳鼠原代心肌细胞的分离和培养选12日龄SD大鼠乳鼠 湖北省实验动物研究中心，许可证号：SCXK（鄂）2020-0018，大鼠乳鼠原代心肌细胞分离培养方法参照如前所述8，具体方法简述如下：取SD大鼠乳鼠心脏剥离血管成分，剪成1 mm1 mm1 mm的组织块，加入 0.125%胰蛋白酶进行消化，加入DMEM/F12培养液 含有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和0.1 mmol/L 5-溴脱氧尿苷（抑制成纤维细胞生长）培养24 h差时贴壁，分离大鼠乳鼠原代心肌细胞后，使用腺病毒感染大鼠乳鼠原代心肌细胞，6 h后更换为无血清培养液
