1、脑与神经疾病杂志年第卷第期？论著调控自幢在肌营养不良症肌纤维损害中的研究卜一张慧卿韩敬哲张金茹王宁马少娟吴红然宋学琴【摘要】目的探索哺乳动物雷帕霉素靶点（）相关自嗤调节通路在小鼠骨骼肌纤维中有关线粒体形态学异常以及肌肉萎缩和坏死过程中所处的地位和作用。方法选取龄雄性小鼠为实验组，同龄 小鼠为对照组，每组各只，取股四头肌组织，通过病理染色观察肌肉组织病理学改变，应用电镜技术观察线粒体的形态变化，应用免疫荧光染色技术观察自噬泡标志物微管相关蛋白轻链（，）和线粒体标志物电压依赖性阴离子通道（，）的共定位情况，利用技术分析相关自睡调控通路蛋白的表达，应用技术分析自嗤相关基因的表达水平。结果与对照组相比
2、，龄小鼠股四头肌组织萎缩，肌纤维内可见核内移、肌再生及炎性细胞浸润；电镜下可见线粒体体积变小，数量增多，并出现线粒体肿胀、嵴消失现象。免疫荧光可见线粒体标记物和自噬泡标记物的团块状聚集，两者的共定位增加。自噬相关基因蛋白及基因表达上升、线粒体自噬相关基因 明显上升，通路下游相关基因蛋白表达水平下降。结论龄小鼠股四头肌组织内肌纤维存在变性和坏死，线粒体形态学异常。的活性降低，自噬相关蛋白表达水平升高，该阶段自噬通路处于激活状态。【关键词】小鼠；肌营养不良症；自睡中图分类号：文献标识码：文章编 号：（），：，：，；（），：，（），基金资 助：河北省政府 资助临床医学优 秀人才 项目（）作者单位：石
3、家庄，河北医科大 学 第二医院，河北省 重点实验室（张金茹、王宁、马 少 娟、吴红然、宋学琴）；承德医学院附属医院神经内科（卜一）；沧州市中心医院（张慧卿）；衡水市人民 医院（韩敬哲）通信作者：宋学琴，：脑与神经疾病杂志年第卷第期 ，；杜氏肌营养不良症（，）是肌营养不良 中最常见、最致命的连锁遗传性疾病。是由编码肌营养不良蛋白的抗肌萎缩蛋白（）的基因突变引起本研究，通过观察小鼠（龄）肌肉萎缩和坏死、线粒体形态学异常等现象，结合相关自噬调控因子变化，推测哺乳动物雷帕霉素靶点（，）在疾病中所发挥的机制和作用，并寻找可能的药物干预靶点。材料与方法？实验动物与试剂实验动物为鼠，购于南京大学模式动物研究
4、所，以下简称小鼠。小鼠，由河北医科大学第二医院神经内科实验室提供，以下简称 小鼠。选取的雄性小鼠作为实验组，的雄性 小鼠作为对照组，每组各取只。双色红外荧光呈像系统（美国公司），倒置研究型荧光显微镜（日本公司），扩增仪，兔抗单克 隆抗体（中 国公司），兔抗单克隆抗体（美国公司），兔抗单克隆抗体（中 国公司），兔抗（中 国公司），兔 抗（中 国公司），兔抗抗体（美国公司），荧光二抗（美国公司），“”试剂盒（美国 公司）组织病理取材与切片染色实验动物经水合氯醛腹腔麻醉，取各组小鼠股四头肌，用生理盐水浸湿的无菌纱布包裹，立即送至处置室，进行包埋冷冻处理。苏木精伊红染色：苏木精染液染色，流水冲洗，伊红
5、染液染色，快速水洗，脱水封片。染色：苏木精（过滤）染色，流水冲洗，染液，脱水透明两次，封片。染色配置底物作用液：萘酚磷酸液，六偶氮对品红液，醋酸缓冲液。底物作用液染色孵育，流水冲洗，脱水透明两次，封片。冷冻切片免疫荧光法常温下将小鼠肌肉组织风干，缓冲液冲洗，打孔，马血清封闭后滴加适量一抗，于尤摇床过夜。次日加人荧光二抗，用含有、抗荧光淬灭剂的甘油封片，在荧光显微镜下观察。透射电子显微镜取材固定：新鲜组织确定取材部位取材，迅速投人电镜固定液丈固定。磷酸缓冲液（）漂洗次，每次；后固定：锇酸磷酸缓冲液室温固定。磷酸缓冲液漂洗次，每次；脱水：组织依次人酒精丙酮丙酮脱水，每次；渗透：丙酮：包埋剂：渗透，
6、丙酮：包埋剂：渗透过夜，纯包埋剂，将纯包埋剂倒人包埋板，将样品插入包埋板后烤箱过夜；包埋：弋烤箱聚合；切片：超薄切片机切片超薄切片；染色：铀铅双染色（醋酸铀饱和酒精溶液，枸橡酸铅，各染色），切片室温干燥过夜；透射电子显微镜下观察，采集图像分析。提取和实时定量分析用法提取各组细胞总，核酸定量仪检测的纯度和浓度。之后进行逆转录，扩增。根据原始检测结果，按照相对定量计算公式，计算出各样品的目的基因相对定量结果，相对于对照样品，进行统计学分析。引物序列如下上游，下泰，上游下龠，上游，下燊，上游，上游 下滌，上游，下，脑与神经疾病杂志年第卷第期蛋白印迹法取适量小鼠股四头肌组织，用裂解液提取组织总蛋白，根
7、据法测定标准曲线，计算总蛋白浓度，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后用封闭，加人兔单克隆抗体（、，比例：）作为一抗，孵育过夜，羊抗兔（比例：）二抗室温孵育，最后用 双色红外荧光成像系统扫膜并分析结果。？统计学方法使用软件制图表、统计软件分析数据。实验结果数据采用非配对检验，统计显著性。以为差异有统计学意义。结果小鼠骨骼肌组织可见肌纤维萎缩、炎细胞浸润（图）。小鼠小鼠注：小鼠骨骼肌苏木精伊红染色；小鼠骨骼肌染色；小鼠骨骼肌染色；小鼠骨骼肌染色显示肌纤维大小不等，炎细胞浸润；小鼠骨骼肌染色；小鼠骨骼肌染色显示部分区域酶活性增 髙图小鼠和小鼠常规染色 注：小鼠；小鼠骨骼肌显示线粒体肿胀、嵴消失、空泡样改变
8、图小鼠和小鼠透射电子显微镜呈像龄的小鼠股四头肌染色显示肌纤维束边界清楚，肌束衣和肌内衣结缔组织明显增生，少量炎细胞浸润（图箭头）。肌束内肌纤维大小不等，可见高收缩纤维，坏死和吞噬肌细胞，可见核内移等现象。染色未见明显异常。染色可见部分区域酶活性增高（图箭头）。小鼠常规染色主要体现了肌纤维的坏死和炎症，以及纤维化和高收缩纤维的改变。小鼠骨骼肌组织电子显微镜下 可见线粒体形态和数量的改变（图）。透射电子显微镜发现，相比 小鼠（），小鼠骨骼肌组织（）线粒体体积变小，数量增多，并出现线粒体肿胀、嵴消失（红箭头），严重者可出现空泡样改变（蓝箭头），提示了线粒体形态的异常可能存在自噬的障碍或激活。小鼠骨骼
9、肌组织中线粒体自噬增强（图）。注：和小鼠骨骼肌组织和免疫荧光染色和共定位（）图免疫荧光染色可见小鼠肌肉组织中线粒体标记物和自噬泡标记物的团块状聚集，同时两者的共定位增加。小鼠骨骼肌组织中表达量下降，自噬通量增强（图）。注：、和带；、和表达量化统计图、和蛋白表达水平 图、和的表达可见相对于小鼠，小鼠和蛋白表达上调，信号通路下游、和的蛋白表达下调，代表了脑与神经疾病杂志年第卷第期信号通路的抑制，提示了自噬调控通路的激活。结果差异有统计学意义（）。显示，相对于组，组、和的水平上调，提示了自噬通量增加，进一步证实自噬通路的激活。（图）结果差异有统计学意义（）。讨论患者骨骼肌病理表现为肌细胞的萎缩，炎症
10、和坏死。已有研究证实小鼠模型中，存在肌纤维变性、萎缩，异常线粒体堆积等现象。越来越多的证据表明自噬在维持肌细胞的数量和肌纤维完整性方面起到重要作用作者前期研究发现患者的骨骼肌组织中存在线粒体自噬的形态学改变，发现自噬泡标记物和线粒体标志物的聚集和增多，结合在自噬调节中的重要作用，针对的模型鼠小鼠进行了调控自樓在肌营养不良肌纤维损害中的研究。自噬是一种细胞分解代谢的过程，该过程的核心是双膜囊泡的形成。为成熟自噬泡的标志物，还和许多自噬受体，如相互作用。不同待降解产物都需要与相联系，其主要功能是将泛素化蛋白分离成更大的蛋白聚集物或凝析物，最终被溶转录因子（，），是亮氨酸拉链类转录因子中的家族成员，
11、其主要功能涉及促进溶酶体的生成，自噬泡和溶酶体的融合等。平时位于细胞质中，激活后转位到细胞核内，可调控自噬相关基因（溶酶体水解酶、溶酶体膜蛋白和自噬蛋白等基因）的转录，激活自噬研究表明，通过钙调磷酸酶的脱磷酸化，促进在核内的聚集。维持正常的自噬是限制肌肉损伤的重要生理过程。或肌肉特异性敲除可导致肌肉萎缩、功能障碍和肌病。抑制液泡蛋白分选（，）活化，减少自嗤体的形成，可导致厮维核内移本研究发现小鼠股四头肌肌肉组织苏木精伊红染色肌纤维大小不等，其内少量炎细胞浸润。可见高收缩纤维，坏死和吞噬肌细胞，可见核内移、肌再生等现象。通过及，发现小鼠骨骼肌和的基因和蛋白水平，的基因水平均高于组，提示此阶段自噬
12、通量是增加的，自噬流是通畅的。考虑到小鼠中存在线粒体功能异常，我们想进一步明确小鼠骨骼肌线粒体自噬情况。作为自噬的一种重要方式，线粒体自噬是指通过自噬机制对线粒体进行选择性降解因此，与任何自噬过程一样，线粒体自噬需要将细胞内成分吞噬成称为自噬体的双层膜，然后与溶酶体融合，由溶酶体酶降解。线粒体自噬主要的蛋白包括和。是可以定位到线粒体的主要功能蛋白，当线粒体功能正常时，很少在线粒体积累，一旦线粒体功能异常，膜电位的丧失会导致在其外膜上聚集，进而招募、磷酸化并激活泛素连接酶。受损的线粒体已被标记的双侧膜包裹成自噬小体，激活的将招募到受损的线粒体，继而被溶酶体降解。本研究通过透射电子显微镜发现：组小
13、鼠骨骼肌纤维内线粒体形态学和线粒体数量的改变，如线粒体体积变小，数量增多，并出现线粒体肿胀、嵴消失，严重者可出现空泡样改变，提示了线粒体形态的异常可能存在自噬的障碍或激活。通过免疫荧光发现：组中线粒体标记物和自噬泡标记物的团块状聚集，同时两者的共定位增加，这与电镜观察到的结果一致：证明线粒体确实存在着自噬的异常。通过，我们发现实验组和的水平是增 加的，提示损伤的线粒体增加。尽管和的及蛋白水平增加，提示自噬处于激活状态，但激活的自噬通量，不足以清除异常的线粒体，这可能是异常线粒体堆积的原因之一。整体来说，在周小鼠骨骼肌组织中，我们的研究证实自噬处于激活状态。但自噬的激活受到何种因子或者通路的调控
14、？这是我们进一步需要解决的 问题。作为调节细胞生长、自噬和凋亡的重要级联蛋白，在的发生发展中具有重要作用。研究发现，小鼠肌肉的进行性肌肉无力和萎缩与再生潜能下降和信号通路激活的变化有关。应用雷帕霉素抑制通路，促进自噬，可以显著改善小鼠的运动耐力，纠正行为学异常。因此，调控可能成为干预自噬水平的重要手段。作者发现，下游因子、和蛋白表达下调，提示活性下降。而是直接的作用靶点。被磷酸化后的蛋白激酶，可以使更多的局限在细胞质。相反，应用雷帕霉素抑 制的活性，可以促进在线粒体肌病小鼠肌纤维细胞核内的定位岡。本研究中基因的表达处于增 高状态，结合下游蛋白表达水平下降，提示活性降低的脑与神经疾病杂志年第卷第
15、期可能促进了的激活，进而促进自噬的激活。本研究通过小鼠骨骼肌纤维内存在形态异常、变性和坏死，骨骼肌线粒体形态异常。和基因及蛋白水平上调，结合其他自噬相关蛋白、基因水平表达上调，强烈提示此阶段自噬是激活的。同时下游因子表达下调，提示信号通路的抑制，进一步证实自噬通路的激活。综合分析，的小鼠骨骼肌组织存在变性和坏死，基本可模拟的肌肉病理改变，但本研究还有局 限性，比如没有进行胞浆、胞核中的比较，进一步明确的具体定位，没有通过相关手段调控活性来观察自噬相关指标的变化，这需要进一步研究。利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突作者贡献声明卜一：论文写作与数据分析；张慧卿：实验实施；韩敬哲、张金茹、王宁：实验动物资料收集与整理；吴红然、马少娟：组织切片与染色；宋学琴：审阅论文和指导参考文献，：，：，（）：，：，：，：，：，：，（）：，：，：，：，：，（）：，；：，（）：，（）：，（）：（收稿日期：）
