1、circNA PMT5 对乳腺癌 MCF-7 细胞增殖、凋亡和侵袭的影响曹茵，郑锐年，黄珂铭，林正权，陈桂林，陈丽娟，叶惠荣基金项目:广东省基础与应用基础研究项目(2021A15150101156)作者单位:523018 广东 东莞，南方医科大学附属东莞医院乳腺科(曹茵、黄珂铭、林正权、陈桂林、陈丽娟、叶惠荣)，肿瘤内科(郑锐年)作者简介:曹茵，本科，主任医师。主要从事乳腺肿瘤方向研究通讯作者:叶惠荣，E-mail:2907867440 qq com 摘要 目的探究环状 NA PMT5(circPMT5)对乳腺癌 MCF-7 细胞增殖、凋亡、侵袭的影响。方法采用qT-PC 检测乳腺癌组织和细胞
2、中 circPMT5 的表达;shNA-NC 和 circPMT5-shNAs 转染至 MCF-7 细胞后，应用qT-PC 检测 circPMT5 的相对表达水平;克隆形成实验、流式细胞术、Transwell 和划痕实验分别检测细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移能力;Western blot 法检测 Ki-67、Survivin、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和 MMP-9 的蛋白表达水平。体内异种移植瘤实验验证 circPMT5 在肿瘤生长中的作用。结果circPMT5在乳腺癌组织和细胞中高表达(P 0.05)。与对照组相比，
3、干扰 circPMT5 表达能抑制 MCF-7 细胞增殖、侵袭和迁移，促进细胞凋亡(P 0.05)。在体内实验中，与 shNA-NC 组比较，circPMT5-shNA1 组肿瘤体积和肿瘤质量显著减小，Ki-67 阳性细胞数显著减少，而 caspase-3 阳性细胞数显著增多(P 0.05)。结论干扰 circPMT5 可抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡。关键词 环状 NA PMT5;乳腺肿瘤;细胞增殖;细胞凋亡;Ki-67;caspase-3;基质金属蛋白酶-2;基质金属蛋白酶-9 中国图书资料分类号 737 9 文献标志码 A 文章编号 1002-3429(2023)04-0
4、142-07 DOI 103969/j issn 1002-3429 2023 04 030Effects of circNA PMT5 on Proliferation，Apoptosis and Invasion ofBreast Cancer MCF-7 CellsCAO Yina，ZHENG uinianb，HUANG Keminga，LIN Zhengquana，CHEN Guilina，CHEN Lijuana，YEHuirongaa Department of Breast Disease，b Department of Oncology，Dongguan Hospital Af
5、filiated to Southern Medical University，Dongguan，Guangdong 523018，China AbstractObjectiveTo investigate the effect of circular NA PMT5(circPMT5)on proliferation，apoptosisand invasion of breast cancer MCF-7 cells MethodscircPMT5 expression in breast cancer tissues and cells was detectedby qT-PC circP
6、MT5 expression was detected by qT-PC after transfection of shNA-NC and circPMT5-shNAs intoMCF-7 cells Cell proliferation，apoptosis，invasion and migration were detected by clonal formation assay，flow cytometry，Transwell assay and scratch assay，respectively The protein expression levels of Ki-67，Survi
7、vin，cleaved caspase-3，cleavedcaspase-9，matrix metalloproteinase-2(MMP-2)，and MMP-9 were detected by Western blot The effect of circPMT5 ontumor growth was verified by xenotransplantation in vivo esultscircPMT5 was highly expressed in breast cancer tissuesand cells(P 0.05)Compared with the control gr
8、oup，interfering the expression of circPMT5 could inhibit cell prolifera-tion，invasion and migration，and promote cell apoptosis(P 0.05)In vivo，compared with the shNA-NC group，thetumor volume and mass of circPMT5-shNA1 group were significantly reduced，the number of Ki-67 positive cells was signif-ican
9、tly reduced，and the number of caspase-3 positive cells was significantly increased(P 0.05)ConclusionInterferingcircPMT5 can inhibit the proliferation，migration and invasion of breast cancer cells and promote apoptosis Key words Circular NA PMT5;Breast neoplasms;Cell proliferation;Apoptosis;Ki-67;cas
10、pase-3;Matrix met-alloproteinase-2;Matrix metalloproteinase-9乳腺癌是全球常见恶性肿瘤1。临床乳腺癌患者表现出遗传多样性，这使乳腺癌研究变得复241杂2。手术、放疗、化疗等方法治疗乳腺癌的效果虽有提高，但预后仍不尽如人意3。因此，了解乳腺癌的潜在分子过程以探索治疗靶点的新型生物标志物具有重要意义。环状 NA(circNA)为具有闭环结构的新型特殊 NA 簇，不包含5端帽和3端 po-ly(A)尾4。circNA 已被证明在乳腺癌生物学过程的调节中发挥着至关重要的作用，包括生长、分化、代谢和转移5，如 circHIPK3 通过靶向 mi
11、-326促进乳腺癌的进展6，circ_0043278 通过 mi-455-3p/EI24 信号通路抑制乳腺癌进展，可作为乳腺癌新的预后预测因子或潜在治疗靶点7;circPMT5在多种恶性肿瘤中发挥致癌作用。circPMT5 高水平表达提示胃癌患者预后不良8。circPMT5 与食管癌的淋巴转移和远处转移呈正相关，并通过靶向mi-203 促 进 食 管 癌 细 胞 的 迁 移9。然 而，circPMT5在乳腺癌中的生物学作用仍有待研究。本文旨在探究 circPMT5 对乳腺癌 MCF-7 细胞增殖、凋亡及侵袭的影响。1材料与方法1.1实验材料选择2020 年7 月2021 年10 月在我院行乳腺
12、癌切除手术的患者癌组织和癌旁组织(距离肿瘤3 cm以内)病理样本(液氮中保存)21 例。均为女性，年龄 35 55(41 35 5 21)岁，均有完整的临床病理资料，患者术前未进行过放疗或化疗。所有患者对研究知情同意，且经本院伦理委员会批准通过。另取正常乳腺组织(距肿瘤 5 cm 以外)10 例作为对照组。人乳腺癌细胞株 SKB3、BT549、MCF-7、MB-MDA-468、HCC1937 和乳腺上皮细胞 MCF-10A 均购自美国 ATCC 细胞库。MB-MDA-468 和 MCF-10A细胞培养于含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基中，SKB3、BT549、MCF-7 和 HCC193
13、7 细胞培养于含10%胎牛血清的 PMI-1640 培养基，所有细胞均在37、5%CO2培养箱中培养。circPMT5 干扰载体购自上海吉凯基因医学科技公司;10%胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM 和 PMI-1640 培养基、Lipofectamine 2000 和 TIzol 购自美国 ThermoFisher 公司;PrimeScriptTMT 试剂盒购自日本 Takara 公司;结晶紫染色液、IPA 裂解液(强)、BCA 试剂盒和 Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物公司;针对 Ki-67、Survivin、-actin、caspase-3、caspase-9
14、、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和 MMP-9 的一抗和相对二抗购自英国 Abcam 公司。SpectraMax iD5 酶标仪购自美国Molecular Devices 公司;GeneAmp PC 系统 9700 和ABI7500 实时荧光定量 PC 仪购自美国 Applied Bi-osystems 公司;AccuriTMC6 流式细胞仪购自美国 BDBiosciences 公司;IX71 倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司。1.2T-qPC 检测 circPMT5 表达水平使用 TIzol 从细胞中分离总 NA，应用 Prime-ScriptTMT 试剂盒在 GeneAmp PC
15、 系统 9700 中逆转录成 cDNA。qPC 在 ABI 7500 实时 PC 系统进行。基因引物序列:circPMT5 正向引物 5-CACCT-TCAGCCATCCCAACAGAG-3，反 向 引 物 5-CCAT-GAGAACATCCCAGGAGAGTG-3;-actin 正向引物5-CCTGGCACCCAGCACAAT-3，反向引物 5-GCT-GATCCACATCTGCTGGAA-3。热循环条件:95 30 s，95 5 s，60 30 s，40 个循环。所有结果均以-actin 为基准进行归一化，用 2 Ct计算。1.3MCF-7 细胞转染分别将 circPMT5-shNA1、s
16、hNA2、shNA3及阴性对照 shNA-NC 通过 Lipofectamine 2000转染至 MCF-7 细胞干扰 circPMT5 的表达，采用qT-PC 检测 circPMT5 表达水平。1.4克隆形成实验检测细胞增殖情况转染后的 MCF-7 细胞重新悬浮并以1 103个/孔的密度铺在 6 孔板中，并在37 下孵育14 d。菌落用无水甲醇固定，0 1%结晶紫染色20 min。然后对细胞集落进行计数和分析。1.5Western blot 法检测蛋白表达转染 48 h 后用 IPA 裂解缓冲液提取蛋白质，并通过 BCA 试剂盒进行定量。通过 10%SDS-PAGE 分离蛋白质并转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜与 5%脱脂奶粉在室温下孵育 2 h 以阻断非特异性结合，然后将膜与一抗在 4 孵育过夜。将膜与二抗在室温下孵育1 h，蛋白质条带通过暴露于 ECL溶液化学发光显色，通过 Image J 软件分析灰度值。1.6细胞凋亡、侵袭、迁移检测方法将转 染 的 MCF-7 细 胞(5 104个/孔)以1 000 g 离心 5 min，弃上清后，将 Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI
