1、八角枫内生放线菌的分离及发酵产物杀松材线虫活性研究吕净彦1，于金英2，李凯3，汪冶1*（1.丽水学院 生态学院，浙江 丽水 323000；2.浙江理工大学 生命科学与医药学院，浙江 杭州 310018；3.丽水市莲都区老竹林业工作中心站，浙江 丽水 323000）摘要：筛选对松材线虫具有毒杀作用的生防放线菌。通过组织分离法从八角枫茎、叶、枝组织中共分离得到 17 株内生放线菌，经摇瓶培养、乙酸乙酯萃取制备胞外、胞内次生代谢产物，采用浸渍法开展内生放线菌代谢产物对松材线虫的室内毒力实验。从中筛选出 2 株内生放线菌（G-5 和 G-17）的胞外代谢产物杀线虫活性显著，G-5 和 G-17 胞外发
2、酵产物经 24 h 处理后 LC50值分别为 0.952 7 和 0.419 6mg mL-1。通过形态学观察和分子生物学手段 16SrDNA的序列分析对两株活性菌株进行鉴定，经鉴定二者均属链霉菌属（Streptomyces）。结果表明：八角枫内生放线菌 G-5、G-17 胞外发酵产物对松材线虫具有较高的毒杀活性，在松材线虫病的生物防治中具有潜在的应用价值。关键词：松材线虫；八角枫；内生放线菌；胞外发酵产物doi：10.3969/j.issn.2095-3801.2023.02.006中图分类号：S763.3文献标志码：A文章编号：2095-3801（2023）02-0034-09Isolat
3、ion ofEndophyticActinomycetesfrom Alangium chinense andFermentation ProductsofAgainst Bursaphelenehus xylophilusLYUJingyan1,YUJinying2,LI Kai3,WANGYe1*（1.School ofEcology,Lishui University,Lishui 323000,Zhejiang；2.School ofLife Sciences and Medicine,ZhejiangSci-Tech University,Hangzhou 310018,Zhejia
4、ng；3.Laozhu ForestryWork Center Station,Liandu District,Lishui City,Lishui 323000,Zhejiang）Abstract：Screening of biotic actinomycetes has virulent effect on pine nematodes.A total of 17 strains ofendophytic actinomycetes are isolated from the stem,leaf and branch tissues of Alangium chinense(Lour.)H
5、arms by tissue isolation,and the extracellular and intracellular secondary metabolites were prepared byshaking flask culture and ethyl acetate extraction.The nematicidal activity of the extracellular metabolites oftwo endophytic actinomycete strains(G-5 and G-17)was significant,and the LC50values of
6、 the extracellular收稿日期：2022-08-09；修回日期：2022-10-13基金项目：丽水市科技计划项目“处州白莲低聚原花青素开发利用研究”（2019GYX07）作者简介：吕净彦，女，山西运城人。*通信作者：汪冶，男，安徽怀宁人，研究员，博士。丽 水 学 院 学 报JOURNAL OF LISHUI UNIVERSITY第 45 卷第 2 期Vol.45No.22023 年 3 月Mar.2023松材线虫（Bursaphelenehus xylophilus,Pinewilt nematode，PWN）是我国危害较大的外来入侵物种之一，属蠕形动物门滑刃目滑刃科伞滑刃属。松
7、树萎蔫病（Pine wilt disease,PWD）是由松材线虫引起的松树病害。由于松材线虫营寄生生活，经由松褐天牛传播，寄生于松树体内取食，位置隐蔽，能使大量松树迅速死亡，造成巨大经济损失，所以引起了国内外的高度重视。目前该病在中国、日本、美国、韩国等均有分布。1982 年，在我国南京中山陵首次发现该病1。松材线虫被林业部列为森林病虫害之首，目前普遍防治策略为化学防治，但其会累及其他生物，且会对环境造成一定程度的破坏。目前针对松材线虫的生物防治针对细菌和真菌研究较多，因而筛选对松材线虫具有毒杀作用的生防放线菌尤为重要2。植物内生菌是一类具有重要应用价值的微生物资源，内生放线菌几乎存在于所有
8、的植物中，许多植物的提取物具有抑菌、抗肿瘤等生物活性，与其共生的内生放线菌也极有可能具有相似的活性3。通过对微生物菌株的发酵使其生产具有生物活性的代谢产物，并将其用于病虫草害的控制是目前创制生物农药的重要途径，如目前正在使用的梅岭霉素、多氧霉素、阿维菌素和甲维盐等4。因此，利用我国的植物内生菌资源筛选抗松材线虫活性物质，对促进新型生物农药的开发具有十分重要的意义。关于杀线虫微生物活性产物方面的研究，前人已经做了很多工作。田阳等从渤海不同深度海水样品中筛选出的具有较高杀线虫活性的生防菌株BH3A8，经测定，稀释 16 倍后其杀线虫活性可以达到 100%5；王方等从池塘里采集的池塘水、淤泥、地衣、
9、青苔等样品中分离出 120 株菌，筛选出 l株具有较高杀线虫活性的细菌 G8-1，其对线虫的校正死亡率为 90.78%6。本研究利用八角枫科八角枫属植物八角枫（Alangium chinense（Lour.）Harms）的茎、枝、叶组织，从中培养分离筛选出具有毒杀松材线虫作用的内生放线菌，并对具有高杀线虫活性菌株进行形态特征和分子生物学鉴定，为我国植物源杀线虫剂的研究提供参考数据资源，为促进我国新型安全高效的杀线虫剂研发提供理论依据。1材料与方法1.1供试材料1.1.1供试植物样本2021 年 9 月在浙江省丽水市白云山采集健康八角枫植物茎（表皮）、枝（三年生）、叶组织。1.1.2供试线虫松材
10、线虫分离于丽水林区疫木。1.1.3培养基高氏一号培养基：可溶性淀粉 20 g，KNO31g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，FeSO40.01 g，琼脂 20 g，加蒸馏水至 1 000 mL，pH 7.27.4，121 下灭菌 20 min。PDA 培养基：马铃薯200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 16 g，加蒸馏水至 1 000mL，pH 自然，121 下灭菌 20 min。高氏一号液体培养基：可溶性淀粉 20 g，KNO31 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，FeSO40.01 g，琼脂 20g，加蒸馏水至 1 0
11、00 mL，pH 7.27.4，121下灭菌20 min。1.1.4主要试剂1%DMSO、乙酸乙酯、M9 缓冲液（KH2PO43fermentation products of G-5 and G-17 were 0.952 7 mg mL-1and 0.419 6 mg mL-1after 24 h treatment,respectively.The two active strains were identified as Streptomyces.The results showed that the extracellularfermentation products of endo
12、phytic actinomycetes G-5 and G-17 from Streptomyces sp.were highly toxic andhad potential applications in the biological control of pine wood nematodes.Key words：pine wood nematode;Alangium chinense（Lour.）Harms;endophytic actinomycetes;extracellularfermentation products吕净彦，于金英，李 凯，等：八角枫内生放线菌的筛选及发酵产物
13、杀松材线虫活性研究第 2 期35g，Na2HPO46 g、NaCl 5 g，MgSO40.12 g，加蒸馏水至 1 000 mL，115 下灭菌 20 min）、线虫裂解液（KOH 2 g，10%NaClO 10 mL，加蒸馏水至 100mL，现配现用），除乙酸乙酯为化学纯外其他试剂均为国产分析纯。1.1.5实验设备TG16G 离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）、KS 4000i control 恒温摇床（IKA）、SG250H 超声波清洗器（上海冠特超声仪器有限公司）、R-210旋转薄膜蒸发仪（BUCHI）、旋涡混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）、生化培养箱（上海森信实验仪器有限公司）
14、、SQP 电子天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。1.2试验方法1.2.1松材线虫的培养采用贝尔曼（Baermann）漏斗法对疫木中线虫进行分离7，待大多数线虫怀卵后同期化处理，接入长满灰葡萄孢菌的 PDA 培养基 28 恒温培养23 d 后得到处于 L4 期线虫，备用。1.2.2八角枫内生放线菌分离及纯化取新鲜八角枫装入无菌塑料袋，在超净工作台上将样品进行消毒。八角枫植物材料用清水洗净，无菌水清洗 23 次，取八角枫叶、茎、枝三个部位，茎、枝切成 12 cm 小段、叶切成 1 cm2小块，先用 75%酒精浸泡 30 40 s 后用无菌水清洗 3 次，然后根据外植体的不同类型用 0.1%升汞
15、浸 35min 消毒后用无菌水清洗 3 次，将处理好后的植物部位接种于高氏一号培养基平板上，用封口膜封好，将平板置于 28 恒温培养箱培养 57 d。待在平板上长有菌落后，用接种环在无菌条件下挑取单菌落，并划线于对应的已配制好的培养基上。置于 28 的培养箱中恒温培养，于 57 d、814 d 后观察放线菌的生长状况。同时，检查培养基上是否含有杂菌，若有其他杂菌，则进一步进行分离纯化，直到获得纯菌为止。1.2.3八角枫内生放线菌的鉴定形态学鉴定：用灭菌接种针挑取菌丝接种于高氏培养基上，于 28 培养箱中培养 35 d，观察菌落的形态特征。挑取纯化后的菌丝制作放线菌显微玻片，通过显微观察菌丝和孢
16、子丝形态等特征，根据菌株的形态特征，查阅相关文献，比对观察结果，初步确定菌株的分类地位。分子生物学鉴定：采用硅基质吸附柱法从放线菌中抽提 DNA。正向引物 27F（5-AGAGTTT-GATCCTGGCTCAG-3）；反向引物 1492R 序列（5-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3）扩增 16S 区序列。PCR 扩增条件：95 预变性 5 min，扩增 40 个循环（95 变性 15 s，50 退火 20 s，72 延伸 40 s）。采用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物。PCR 产物送上海元莘生物医药科技有限公司测序。利用NCBI-BLAST（https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）对所测内生放线菌 16S 区序列进行同源性比对，得到放线菌序列同源性最相似种属，借助软件MEGA11（Mega Limited；新西兰）采用邻接法（Neighbor-joining）构建系统进化树，确定各分离菌株的种类。1.2.4八角枫内生放线菌胞外、胞内代谢产物制备待纯化的放线菌在高氏培养基上长满整个平板以后，在无菌条件下将分离纯化的放线菌菌株
