1、DOI：10.13430/ki.jpgr.20220909001植物遗传资源学报 2023，24（3）：758-766Journal of Plant Genetic ResourcesPpMYB10.1启动子483 bp缺失与红肉桃果肉颜色形成关系的研究王蛟，曹珂，王玲玲，王力荣（中国农业科学院郑州果树研究所，郑州450009）摘要：以红色深浅不一的红肉桃种质为材料，探讨影响其花色素苷含量的分子机理，为高效选育红色深浅不等的红肉桃品种提供理论依据。利用GUS染色测定桃果肉花色素苷重要基因PpMYB10.1的启动子活性，利用DNA-pulldown鉴定结合于PpMYB10.1启动子上的转录抑制
2、因子，利用双荧光素酶及酵母双杂交验证转录抑制因子的功能。结果表明：（1）具有深红、红、浅红的桃果肉，其对应的PpMYB10.1表达量及花色素苷含量依次下降。（2）具有483 bp序列的PpMYB10.1启动子，其启动活性弱于缺失该序列的启动子。（3）利用该483 bp序列鉴定到的转录抑制子基因Prupe.2G302800，虽然不能直接抑制PpMYB10.1的转录，但能够结合花色素苷合成的主效基因PpBL，并抑制其转录活性，可能对降低PpMYB10.1表达具有一定功能。本研究通过483 bp缺失序列鉴定到的转录抑制子Prupe.2G302800，虽然不是红肉变浅的直接因素，但通过抑制PpBL转录
3、活性，对于红肉桃红色变浅，可能具有一定作用。关键词：红肉桃；PpMYB10.1；红色深浅；启动子活性Deciphering the Genetic Effect of a 483 bp Deletion in the PpMYB10.1 Promoter to Determine Intensities of the Red-colored Flesh PeachWANG Jiao，CAO Ke，WANG Ling-ling，WANG Li-rong（Zhengzhou Fruit Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Scien
4、ces，Zhengzhou 450009）Abstract：Based on the red-flesh color peaches showing different intensities，this study attempted to decipher their formation mechanism in order to provide theoretical basis for efficient breeding of red peach varieties.The promoter activity of PpMYB10.1 was detected via GUS stai
5、ning，and the candidate transcription repressors binding on its promoter were captured through DNA-pull down assay.The function of these candidate genes were determined by double luciferase and yeast two-hybrid assay.The results showed that：（1）The expression of PpMYB10.1 and anthocyanin content in fl
6、esh peaches with deep-red，red and light-red were gradually decreasing.（2）Activity of PpMYB10.1 promoter with a 483 bp deletion was weaker than that without the sequence.（3）Interestingly，we identified a candidate transcription repressor Prupe.2G302800 based on the 483bp deletion.The protein strongly
7、interacted with PpBL，a major factor in anthocyanin synthesis and resulted in a reduction on the transcription of PpMYB10.1.Prupe.2G302800 is unlikely the direct factor modulating the red flesh of peach，whereas it might play an important role in decreasing red-flesh color by inhabiting PpBL transcrip
8、tion activity.Key words：red flesh peach；PpMYB10.1；different intensities of red-flesh color；promoter activity收稿日期：2022-09-09 修回日期：2023-01-06 网络出版日期：2023-01-18URL：https：/doi.org/10.13430/ki.jpgr.20220909001第一作者研究方向为桃种质资源评价与利用，E-mail：通信作者：王力荣，研究方向为桃种质资源与遗传育种研究，E-mail：基金项目：中国农业科学院科技创新工程专项经费项目（CAAS-ASTIP
9、-2021-ZFRI-01）Foundation project：The Agricultural Science and Technology Innovation Program（CAAS-ASTIP-2021-ZFRI-01）3 期王蛟等：PpMYB10.1启动子483 bp缺失与红肉桃果肉颜色形成关系的研究红肉桃是一类特殊的桃种质资源，因果肉呈红色或紫红色，故也称血桃1。红肉桃富含花色素苷等抗氧化成分，具有清除体内自由基、抗肿瘤、防止心血管硬化等功效2。另外，不同红肉桃品种，花色素苷含量也表现出高低差异3。诸如此类特性，红肉桃被众多消费者所青睐，亦被育种专家作为重点选育对象。红肉桃根据
10、花色素苷大量积累时间，可以划分成两种类型。第一种是成熟期积累型，代表品种有大红袍、天津水蜜等4；第二种是发育中期积累型，代表品种有大果黑桃、哈露红等。成熟期积累型的红肉桃，广泛应用于栽培及育种中，如湖北省农业科学院利用曙光（黄肉）与红肉桃18（红肉）作为亲本，选育出早熟红肉桃品种早仙红5。该类型的红肉，由主效基因PpBL控制，其启动子上的6688 bp转座子插入，是该类型红肉形成的关键变异6。PpBL与PpNAC1形成二聚体，上调调控基因PpMYB10.1转录因子的表达，之后PpMYB10.1又与另外一个转录因子PpbHLH3形成二聚体，上调花色素苷合成通路上的关键结构基因PpDFR与PpGU
11、GT，最终导致花色素苷含量上升，果肉呈现红色7。成熟期积累型的红肉桃，根据花色素苷含量，又可分为深红、红及浅红等不同梯度，极大地丰富了红肉桃的供应类型。Hara-Kitagawa 等6认为PpMYB10.1启动子上游的5243 bp转座子插入，对红肉桃果肉颜色变浅具有一定作用。PpMYB10.1启动子上还存在一段483 bp缺失序列7，该变异是否也参与红肉桃红色深浅形成，以及它们具有什么样的调控机制，目前尚不明确。本研究以红色深浅不等的红肉桃为材料，利用分子生物学手段，研究其形成机制，为高效选育红色深浅不同的红肉桃品种提供理论依据。1材料与方法1.1试验材料用于试验的红色深浅不同的10份红肉种
12、质，均属于成熟期大量积累花色素苷的红肉桃，分别为天津水蜜、园春白、武汉大红袍、微尖红肉、万州酸桃、红桃、大红袍、谷城大红袍、望谟小米桃、武汉2号，以上材料树龄14年，定植于中国农业科学院郑州果树研究所国家桃种质资源圃（郑州）。果肉拍照及样品采集于果实完全成熟时进行，具体为挑选树冠外围35个果实，横切拍照，并切取果皮与果核之间的果肉，迅速置于液氮，完全冷冻后用锡箔纸包裹，置于80 冰箱。1.2桃果肉花色素苷提取与测定花色素苷提取与测定参考赵慧芳等8方法。将冷冻的桃果肉样品研磨成粉末，称取2.0 g，以1 4的料液比例，加入1%的HCL-乙醇溶液（V盐酸 V无水乙醇=1 99），于25 提取2次，
13、每次提取时间为60 min。提取液4000 r/min离心10 min，取上清液定容至100 mL，以测定花色素苷含量。花色素苷含量采用示差法测定。吸取2 mL上述上清液，分别用pH=1.0（0.2 mol/L KCL 0.2 mol/L HCl=25 67）与pH=4.5（0.2 mol/L NaAc 3H2O 0.2 mol/L HAc=1 1）的缓冲液稀释至20 mL，20 mL（2 mL 1%HCl-乙醇+18 mL缓冲液）作为空白对照。缓冲液分别在510 nm与700 nm处测定吸光值A510、A700，利用以下公式计算花色素苷含量。A=(A510 A700)PH1.0(A510 A
14、700)PH4.5ACY=(A 449.2 10 V)/26900 m 100A：吸光值；ACY：花色素苷总含量；V：提取液的总体积；m：取样量；449.2：矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔分子质量；26900：矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数。1.3载体构建为了检测启动子活性，两段PpMYB10.1启动子序列（1126 bp、1609 bp）合成（北京六合华大基因科技有限公司，北京，中国）并连接到pBI121表达载体 多 克 隆 位 点（MCS）区，以 构 建 重 组 载 体：proPpMYB10.1（1126 bp）GUS 及 proPpMYB10.1（1609 bp）GUS，CaMV35
15、S GUS为阳性对照9。为了检测转录因子与下游基因启动之间的互作关系，首先将PpMYB10.1两段启动子（1126 bp与1609 bp）序列合成并连接到pGreen0800LUC载体上，连接位置位于报告基因 LUC 上游10-11，以构建重组载体：proPpMYB10.1（1126 bp）LUC及proPpMYB10.1（1609 bp）LUC，MCS GUS 为阴性对照；之后将PpBL、Prupe.2G302800、PpNAC1 的 CDS 区克隆并A：天津水蜜；B：万州酸桃；C：大红袍A：Tianjin Shui Mi；B：Wanzhou Suan Tao；C：Da Hong Pao图1
16、红肉桃不同红色深浅Fig.1Different intensities of the red-flesh color759植物遗传资源学报24 卷连接到pBI121载体上，连接位置位于 CaMV35S启动子下游，以构建重组载体：CaMV35S PpBL，CaMV35S Prupe.2G302800，CaMV35S PpNAC1，CaMV35S GUS为阳性对照。克隆基因CDS区需要的引物见表1。1.4桃果肉GUS染色为了明确启动子上的483 bp缺失对PpMYB10.1转录活性的影响，将构建好的过表达载体转化到农杆菌感受态细胞GV3101中，28 培养2 d。从平板上挑取单菌落，悬浮于1.0 mL LB培养基中（含50 mg/mL卡那霉素），28 培养10 h。从中吸取10 L，转移到15 mL LB培养基中（含50 mg/mL卡那霉素），28 摇床培养812 h。之后，5000 rpm离心10 min，收集菌体，并用侵染缓冲液（0.5 mol/L MES，1.0 mmol/L MgCL2，1.0 umol/L As）将菌体 OD 值调到 0.40.6。调好的菌液悬浮物于室温静置23
