1、核 农 学 报 2023，37（5）：09360943Journal of Nuclear Agricultural Sciences河北省不同苘麻种群对莠去津的抗性水平及抗性机制研究郭倩颖1，2 李哲1 马树杰2 王明思2 杨娟1，*张利辉2，*（1河北科技师范学院，河北省作物逆境生物学重点实验室，河北 秦皇岛 066004；2河北农业大学，植物保护学院，河北 保定 071000）摘 要：为了明确河北省玉米田杂草苘麻对莠去津的抗性水平及抗性机制，本研究采用整株生物测定法对采自河北省6个不同地区的苘麻种群进行莠去津抗性水平测定，利用酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定解毒代谢酶谷胱甘肽-S-转
2、移酶（GSTs）和细胞色素P450氧化酶（P450s）对莠去津的非靶标抗性，并对靶标基因psbA进行了序列比对和表达量测定。结果显示，种群HB-3对莠去津最敏感，种群HB-6表现为高抗，抑制生长中量（GR50）分别为1 662.75和84 721.13 ghm-2，抗性种群较敏感种群的抗性倍数为50.95；抗性种群HB-6中，GSTs抑制剂NBD-Cl和P450s抑制剂马拉硫磷对莠去津具有增效作用，与未使用GSTs和P450s的处理相比，该种群的GR50分别降低了11.61倍和27.77倍，且GSTs和P450s活性均高于敏感种群HB-3；抗性种群HB-6的靶标基因psbA未发生突变，经莠去津
3、处理后，该种群psbA基因表达量低于敏感种群HB-3。综合上述结果可知，苘麻对莠去津的抗性是由GSTs和P450s介导的解毒代谢作用增强引起的。本研究结果为苘麻的科学防除和莠去津的减量化使用奠定了理论基础。关键词：苘麻；莠去津；GSTs；P450s；抗性DOI：10.11869/j.issn.1000-8551.2023.05.0936苘麻（Abutilon theophrasti Medicus）是锦葵科一年生杂草，危害玉米、大豆等作物，通过竞争光照、水分和养分而造成作物减产1-2。苘麻结籽量大，种子活力高，防控难度较大3-4。近年来，农田耕作制度改变和除草剂单一使用，使杂草群落的演替加快，
4、目前苘麻的发生和危害处于上升态势，已逐渐成为玉米田的恶性杂草。莠去津（atrazine）属于光系统（photosystem complex，PS）抑制剂，能够有效防除玉米田一年生禾本科杂草和阔叶杂草，其对某些多年生杂草也有一定的防除效果且因莠去津既能被杂草根吸收，也能被茎叶吸收，常作为土壤封闭除草剂和苗后茎叶处理剂使用5。但长期大面积使用，加速了抗莠去津杂草生物型的出现，自1972年美国马里兰州首次发现绿穗苋（Amaranthus hybridus L.）对莠去津产生抗性以来，全球共发现抗莠去津杂草生物型66个，从数量上仅次于乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase，ALS）
5、抑制剂类除草剂的杂草抗性生物型6。杂草对除草剂的抗性机制可分为非靶标抗性（non-target-site-based resistance，NTSR）和靶标抗性（target-site resistance，TSR）7-8。非靶标抗性包括减少杂草对除草剂吸收和传导，增强解毒代谢作用以及对除草剂的屏蔽或隔离作用等9。我国辽宁地区的苘麻种群对莠去津产生了较低水平抗性，抗性指数为1.74.010。此外，硬直黑麦草（Lolium rigidum Gaud.）对莠去津产生抗性是由于体内 P450s代谢作用增强所致11。长芒苋（Amaranthus palmeri S.Watson.）抗性种群谷胱甘肽-S
6、-转移酶（glutathione S-transferase，GST）对莠去津的代谢速度比敏感种群快，导致其对莠去津产生抗性12。靶标抗性机制主要是除草剂作用位点的基因发生突变，或者靶标酶过度表达 13。藜（Chenopodium album L.）14、早熟禾（Poa annua L.）15由于psbA基因编码的氨基酸突变（Ser264Gly）导致其对莠去津的吸收能力减弱，从而产生抗性。文章编号：1000-8551（2023）05-0936-08收稿日期：2022-07-13 接受日期：2022-09-05基金项目：河北省省级科技计划资助（19226504D），河北省自然科学基金（C2021
7、407005），河北科技师范学院研究生创新资助项目（CCZZ202104）作者简介：郭倩颖，女，主要从事杂草抗药性研究。E-mail：*通讯作者：杨娟，女，讲师，主要从事杂草生物学与抗药性研究。E-mail：；张利辉，女，教授，主要从事杂草生物学与防控研究。E-mail：。同为通讯作者。9365 期河北省不同苘麻种群对莠去津的抗性水平及抗性机制研究近年来，农业生产上莠去津对苘麻的防治效果不佳，田间推荐剂量不能有效防除苘麻，但目前在我国鲜见解析苘麻对莠去津抗性机制的相关报道。因此，本研究以采自河北省玉米田的 6 个苘麻种群为研究对象，通过整株生物测定法测定苘麻种群对莠去津的敏感性差异，以明确其抗
8、性水平；并从非靶标抗性和靶标抗性两方面对抗性种群的抗性机制进行分析，以期为河北省玉米田苘麻的抗药性治理和延缓抗性杂草发生提供理论依据。1材料与方法1.1试验材料1.1.1供试苘麻种子于2020年秋季和2021年秋季在河北省不同典型地区的玉米田单株采集6个苘麻种群种子（具体采集信息见表1），晾干后放于4 条件下储存备用。1.1.2药剂及试剂38%莠去津悬浮剂（山东滨农科技有限公司），植物基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化技术有限公司），DNA凝胶回收试剂盒、总RNA提取试剂盒II R6934 安诺伦（北京）生物科技有限公司，Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（Hi
9、gh Rox）荧光定量 PCR 试 剂 盒 Hifair 1st strand cDNA Synthesis Supermix for qPCR（上海翊圣生物科技有限公司），大肠杆菌TG1感受态细胞（北京博迈德生物技术有限公司），95%马拉硫磷原药（安徽瑞辰植保工程有限公司），98%NBD-Cl（上海麦克林生化科技有限公司），酶联免疫吸附测定法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）试剂盒、植物谷胱甘肽-S-转移酶、植物细胞色素P450氧化酶（黄石市蓝图生物科技有限公司）。1.1.3试验仪器3WP-2000型行走式喷雾塔（农业农村部南京农业机械化研究
10、所），梯度 PCR 仪、ABI 7500 型实时荧光定量 PCR 仪（美国应用生物系统公司），DYY-6C型电泳仪电源、DUT-48切胶仪（杭州米欧仪器有限公司）。1.2苘麻种群幼苗培养将营养土 蛭石按1 1的比例搅拌均匀，装入7 cm7 cm10 cm花盆中，将上述花盆放入塑料托盘中，灌水，使花盆吸水备用。挑选饱满种子，使用70%酒精浸泡10 min对种子进行消毒，然后用无菌水冲洗3次。将种子放入 60 水浴锅加热 30 min，取出后加入300.00 mgkg-1赤霉素浸泡，放入培养箱（温度：2528，湿度：60%70%，光照/黑暗：14 h/10 h）。待种子露白后播种到花盆中，每盆5颗
11、种子，覆土1 cm，24 h后采用3WP-2000型行走式喷雾塔进行苗前土壤喷雾处理。1.3试验方法1.3.1苘麻种群对莠去津的抗性水平测定采用整株测定法，按1.2所述方法种植6个苘麻种群，38%莠去津悬浮剂施药剂量为 997.50、1 995.00、3 990.00、7 980.00、31 920.00 和 63 840.00 ghm-2，每个处理重复3次，同时设清水对照。施药后观察苘麻对莠去津的反应症状，21 d后剪取所有处理的苘麻植株地上部分，称量鲜重，计算处理占对照鲜重百分比，绘制剂量-反应曲线，计算抑制生长中量GR50及抗性倍数（resistance index，RI）。计算公式如下
12、：Y=YX/Y0 100%（1）Y=C+(D-C)/1+(X/GR50)b（2）RI=抗性种群GR50敏感种群GR50（3）式中，X为莠去津使用剂量；YX为施用剂量为时苘麻地上部鲜重；Y0为不用药对照组苘麻地上部鲜重；Y为莠去津施用剂量为X时苘麻地上部鲜重占对照干重的比率；C为莠去津使用剂量反应下限；D为莠去津使用剂量反应上限；GR50为苘麻生长抑制中量；b 为斜率。1.3.2酶抑制剂 NBD-Cl和马拉硫磷对莠去津的增效作用以苘麻敏感种群HB-3和抗性种群HB-6为研究对象，测定GSTs抑制剂4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑（NBD-Cl）和P450s抑制剂马拉硫磷对苘麻对莠去津
13、抗性水平的影响。按1.2所述方法种植苘麻。分别将 NBD-Cl（270.00 ghm-2）用 50 L 氯仿进行溶解，马拉硫磷（1 000.00 ghm-2）用50 L丙酮进行溶解，之后再用 0.1%吐温-80 水溶液定容至 20 mL。待抑制剂喷施30 min后再进行莠去津药剂处理。莠去津的处理剂量为997.50、1 995.00、3 990.00、7 980.00表1苘麻种群采集地点Table 1Collection locations of A.theophrasti populations种群PopulationHB-1HB-2HB-3HB-4HB-5HB-6采集地点Collectio
14、n locations河北省张家口市宣化区沙岭子镇二里半村河北省邢台市威县东关村河北省保定市南二环五尧新村河北省秦皇岛市昌黎县河北科技师范学院施各庄农场河北省承德市平泉县茅兰沟乡喇嘛洞村河北省邢台市隆尧县双碑乡北村用药历史Herbicide using history1年3年未使用2年1年5年937核农学报37 卷 和 31 920.00 ghm-2。每个处理 3个重复，设 0.1%吐温-80水溶液为对照。处理后21 d按照1.3.1的方法计算抑制生长中量GR50及差异倍数（fold change，FC）：FC=GR50(莠去津)GR50(莠去津+酶抑制剂)（4）。1.3.3苘麻谷胱甘肽-S-
15、转移酶（GSTs）和细胞色素P450 氧化酶（P450s）活性测定选取苘麻敏感种群HB-3 和抗性种群 HB-6 进行 GSTs、P450s 活性研究，按 1.2 所述方法种植苘麻，喷施莠去津田间推荐剂量（1 995.00 ghm-2）。分别于施药前和施药后1、3、5、7、9、14 d 进行取样，用液氮将样品迅速冷冻，置于-80 冰箱保存备用。采用ELISA试剂盒测定解毒代谢酶GSTs和P450s活性。1.3.4苘麻psbA基因克隆及序列比对选取苘麻敏感种群HB-3和抗性种群HB-6，按1.2所述方法种植，待植株生长至4叶期时，剪取叶片用液氮迅速冷冻，放入-80 冰箱保存备用后，采用DNA提取
16、试剂盒提取苘麻 DNA。参考 GenBank 数据库已报道的苘麻 psbA基因序列（NC_053702.1），扩增序列包含已报道的抗性突变位点（表2），将设计好的QM-F1/QM-R1引物送至北京博迈德基因技术有限公司合成，然后采用梯度PCR筛选出引物最佳退火温度。PCR扩增体系为25 L：10 molL-1正反引物各0.5 L、2Tap PCR MasterMix 12.5 L、模板 3.5 L、ddH2O 8.0 L。扩增程序：94 预变性5 min；94 变性30 s，56 退火30 s，72 延伸90 s，共35个循环；72 终延伸10 min。PCR扩增结束后，使用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，切取含有目的条带的凝胶，使用DNA凝胶回收试剂盒对PCR产物进行回收。将回收产物与pMD18-T vector连接，转化至大肠杆菌TG1感受态细胞。经过涂板和37 过夜培养，挑取单菌落进行液体振荡培养4 h，将菌液送到生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST比对，采用DNAMAN V9.0软件对敏感和抗性苘麻种群的psbA基因部分序列进行比对分析。1
