1、 第 卷 第 期 年 月川北医学院学报（：.）.，.：.基础研究基金项目：四川省南充市 年市校合作科研专项（川北医学院）基础研究课题（）；川北医学院 年度校级科研发展计划项目（）；年川北医学院附属医院院级科研项目（）作者简介：冯成敏（），女，硕士，住院医师。：通讯作者：刘海，博士，教授，：喉鳞状细胞癌组织中 的表达及临床意义冯成敏，朱鑫，程瑶，张震，刘海（川北医学院附属医院耳鼻咽喉头颈外科，四川 南充）【摘要】目的：探讨喉鳞状细胞癌（喉鳞癌）组织中 的表达及临床意义。方法：收集行相关手术切除的喉鳞癌组织（）、含正常鳞状上皮的癌旁组织（）、喉鳞状上皮内瘤变组织（）、声带息肉组织（）标本进行 免疫
2、组化染色。比较 在不同组织中的表达情况，分析 的表达水平与喉鳞癌临床和病理特征的关系及影响患者生存时间的因素。结果：在含正常鳞状上皮的癌旁组织、声带息肉组织、喉鳞状上皮内瘤变组织、喉鳞癌组织中的表达依次升高（.）。相关性分析显示，的表达水平与喉鳞癌临床分期及分化程度正相关（.）。单因素分析显示，高表达为影响喉鳞癌患者生存时间的独立危险因素（.）；多因素回归分析显示，高表达不能被判定为影响喉鳞癌患者生存时间的独立危险因素（.）。结论：在喉鳞癌组织中表达升高，可作为早期诊断的新靶标，但不能作为影响喉鳞癌患者生存时间的独立危险因素进行预后预测。【关键词】喉鳞状细胞癌；早期诊断【中图分类号】.【文献标
3、志码】，（，）【】：（）：（），（），（）（），：，（.）（.）（.），（.）：，【】；喉癌是常见头颈部恶性肿瘤，占肿瘤患者的 ，是耳鼻喉科、头颈外科第三常见恶性肿瘤。约 喉癌的病理类型为鳞状细胞癌（喉鳞癌），治疗策略包括手术、放化疗等。但由于肿瘤的异质性，喉鳞癌早期临床症状差异大，因此寻找和鉴别的新生物标记物对早期诊断和治疗有重要意义。黏蛋白（）参与多种疾病的发生发展，是其中一种。主要表达于呼吸道及胃肠道上皮细胞，在黏膜表面起保护和润滑作用。在多种恶性肿瘤中高表达，但在冯成敏，等 喉鳞状细胞癌组织中 的表达及临床意义喉鳞癌组织中的表达及其对早期诊断及预后影响的相关研究尚未见报道。因此，本研究
4、旨在探讨喉鳞癌组织中 的表达及临床意义。资料与方法 一般资料 病理标本选取 年 月至 年 月川北医学院附属医院收治的行相关手术切除患者的喉鳞癌组织（）、含正常鳞状上皮的癌旁组织（）、喉鳞状上皮内瘤变组织（）、声带息肉组织（）。所有患者均经电子鼻咽喉镜检查、颈部 和病理确诊，临床病历资料齐全。术前均未接受放疗、化疗及其它抗肿瘤治疗，无合并其他恶性肿瘤、心血管系统、免疫系统、急慢性感染、严重肝肾功能不全等疾病。主要试剂 抗体（，）购自英国 公司；无水乙醇、二甲苯购自上 海 国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司；柠 檬 酸（.）抗原修复液、苏木素染液、伊红染液、苏木素分化液、苏木素返蓝液、
5、标记山羊抗兔二抗（）购自四维加生物科技（武汉）有限公司；缓冲液、双氧水购自武汉博士德生物工程有限公司；购自北京索莱宝科技有限公司；中性树胶购自美国 公司；组化 显色剂试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。方法 免疫组化染色（）石蜡切片脱蜡脱水：将切片放入二甲苯中脱蜡，重复操作 次，取出切片依次置于无水乙醇、乙醇、乙醇中各 进行梯度脱水，最后置于超纯水中。（）石蜡切片抗原修复：将切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液（.）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火 至沸腾，停火 保温，再转中低火 自然冷却后将玻片置于（.）中在脱色摇床上晃动洗涤 次，次。将切片放入 双氧水溶液中，室温避光孵育 ，将玻片置
6、于（.）中在脱色摇床上晃动洗涤 次，次。（）石蜡切片封闭脱色：在组化圈内滴加 均匀覆盖组织，室温封闭 。轻轻甩掉封闭液，滴加 一抗（），切片平放于湿盒内 孵育过夜。玻片置于（.）中在脱色摇床上晃动洗涤 次，次。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗 标记覆盖组织，室温孵育 。玻片置于（.）中在脱色摇床上晃动洗涤 次，次。（）石蜡切片染色：切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的 显色液，显微镜下控制显色时间，自来水冲洗切片终止显色。苏木素复染 左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。取出切片依次置于 乙醇、乙醇中各 、置入无水乙醇中 重复两次、置入二甲苯中 脱
7、水，中性树胶封片。石蜡切片免疫组化结果判读苏木素染细胞核为蓝色，显出的阳性表达为棕黄色。免疫组化结果判断标准所有组织标本的性质、肿瘤的分化程度由有经验的病理科医师确定。每张切片在显微镜（）下随机选取视野 个（双盲法拍照）。用 软件统计免疫组化着色强度及范围，以癌组织、癌旁、上皮内瘤变、或声带息肉上皮组织区域单位面积光密度值来表示（像素）；阳性区域的色彩值范围：为 ，为 ，为 。统计学分析采用 .软件对数据进行分析与处理。计量资料以（）表示，采用 检验或方差分析；生存曲线采用 法绘制，行 检验；影响因素采用 比例风险回归模型分析。.为差异有统计学意义。结果 在不同喉鳞状上皮病变组织中的表达水平比
8、较免疫组化结果显示，阳性表达在正常上皮主要定位于细胞膜，少量存在于细胞质。在含正常鳞状上皮的癌旁组织、声带息肉组织、喉鳞状上皮内瘤变组织、喉鳞癌组织中的表达依次升高（.）；在含正常鳞状上皮的癌旁组织和声带息肉组织中的表达水平比较，差异无统计学意义（.）。见表、图 及图。喉鳞癌组织中 表达水平与临床及病理特征的关系喉鳞癌组织中 表达水平与患者性别、年龄、肿瘤部位及有无淋巴结转移无关（.）；与患者 分期、临床分期和分化程度有关（.），且高分化、期和临床分期 患者喉鳞癌组织中 表达量高于中低分化、和临床分期期（.）。见表、图 图。喉鳞癌组织 表达与患者生存时间的关系截至随访时间终点，例喉鳞癌患者中死
9、亡 例，生存 例。生存分析及单因素 检验提示，喉鳞癌组织中 表达量（像素）均值的患者死亡率为.；第 卷 第 期 年 月 川北医学院学报（：.）.，.表达量（像素）均值的患者死亡率为.。生存曲线显示，表达量均值患者（）的生存时间低于 表达量 均值患者（），差异有统计学意义（.）。见图。影响喉鳞癌患者生存时间的因素单因素分析显示，肿瘤部位、临床分期、分级、是否有颈部淋巴结转移及 表达量与喉鳞癌患者生存时间有关（.）。法筛选自变量，以单因素中有统计意义的因素为变量赋值：肿瘤部位（声门上、下；声门型）；临床分期（期；期）；分级（；）；是否有淋巴结转移（无转移；有转移）；表达（像素 均值；像素均值），比
10、例风险回归分析显示，声门上下型、临床分期越高、分级越高、有淋巴结转移及 表达含量高为影响喉鳞癌患者生存时间的危险因素，但不能判定为影响患者生存时间的独立危险因素（.）。见表 及表。表 在不同喉鳞状上皮病变组织中的表达水平比较（）组织类型像素 值 值喉鳞癌组织（）喉鳞状上皮内瘤变组织（）含正常鳞状上皮的癌旁组织（）声带息肉组织（）图1MUC13在不同喉鳞状上皮病变组织中的表达（200）声带息肉癌旁上皮内瘤变癌50 mHEMUC13 IHC图2四种组织MUC13免疫组化染色（IOD/像素2）箱式图癌上皮内瘤变癌旁声带息肉25%75%1.51QR内的范围中位线均值异常值0.140.120.100.0
11、80.060.040.020.00-0.02IOD/像素2癌声带息肉癌旁上皮内瘤变 表 喉鳞癌组织中 表达水平与临床及病理特征的关系（，）特征例数 像素 值 值性别 男 女 年龄（岁）临床分型 声门上型 声门型 声门下型 临床分期 分级 淋巴结转移 有 无 分化程度 高分化 中、低分化 图3MUC13在不同分化程度的喉鳞癌组织中表达水平（200）50 mHEMUC13 IHC高分化中分化低分化冯成敏，等 喉鳞状细胞癌组织中 的表达及临床意义图5临床分期期与期喉鳞癌组织中MUC13表达水平箱式图图4中低分化与高分化喉鳞癌组织中MUC13表达水平（IOD/像素2）箱式图中低分化高分化25%75%1
12、.51QR内的范围中位线均值异常值0.140.120.100.080.060.040.020.00IOD/像素2中低分化高分化IOD/像素20.140.120.100.080.060.040.020.00临床分期-期临床分期-期临床分期-期临床分期-期25%75%1.51QR内的范围中位线均值异常值图6TNM分期中T12与T34期喉鳞癌组织中MUC13表达水平箱式图IOD/像素20.140.120.100.080.060.040.020.00T3+T4T1+T2T1+T2T3+T425%75%1.51QR内的范围中位线均值异常值图7喉鳞癌组织中MUC13不同表达量（IOD/像素2）患者的生存曲
13、线生存分析函数累积生存分析1.00.80.60.40.20.0MUC13均值均值均值-检剔后均值-检剔后.0010.0020.0030.0040.0050.0060.00生存时间（月）表 影响喉鳞患者生存时间的单因素因素 值 值性别 年龄 吸烟史 肿瘤部位 临床分期 分级 颈部淋巴结转移 分化程度 表达 表 影响喉鳞癌患者生存时间的多因素变量 值 值 值 值（）值肿瘤部位 临床分期 分级 淋巴结转移 表达 讨论尽管目前早期喉鳞癌的治疗令人满意，但晚期患者预后并不理想，年总生存率约.。因此寻找新的敏感性分子标记物，单独或与经典诊断方法结合应用，在结合特异性的同时实现更好的敏感性，对喉鳞癌的早期诊
14、断具有重要意义。黏蛋白（）在正常生理状况下可为管腔上皮组织提供保护，但其表达的改变或糖基化模式的改变常与肿瘤的进展相关，影响细胞的生长、增殖、转化、粘附、侵袭、及免疫监视。本研究表明，在正常喉上皮及喉良性上皮病变中基本不表达（.）；在喉上皮内瘤变及喉鳞癌中的表达依次升高（.），表明 与喉鳞癌的发生发展有关，可能参与了疾病的发病过程，有可能成为早期诊断的新靶标。本研究发现，在不同临床分期和分化程度的喉鳞癌组织中表达水平也不同，在临床 期中的表达水平高于 期（.），可能参与介导了喉鳞癌的进展。等研究指出，可通过介导（氨基末端激酶）表达上调及激活 的磷酸化使细胞形态发生改变，呈现出散射状形态；的高度
15、磷酸化基团存在于细胞膜外及 分子对细胞粘附分子的干扰作用导致细胞间的聚集作用减弱，结合 于细胞基底区与基底膜部位的定位特点可 第 卷 第 期 年 月 川北医学院学报（：.）.，.导致卵巢癌细胞脱离初始部位侵袭基底组织及发生转移。碳端跨膜结构域包含三个表皮细胞生长因子（）样结构域，可能为相关通路的信号分子。由于 样结构域的存在，可能与 受体如人表皮生长因子（）发生相互作用来调控 信号通路，并通过改变 的蛋白酪氨酸磷酸化调控的信号通路促进卵巢癌细胞的增殖，从而促进卵巢癌的进展。基于此，本研究小组推测 的表达可能对喉鳞癌有相似影响，可减弱癌细胞间的聚集与联系，促进增殖。在高分化喉鳞癌组织中的表达水平
16、高于中低分化者（.），表明 可能参与了喉鳞癌的分化过程。喉鳞癌患者术后随访显示，作为单因素对患者生存时间有影响（.），表达强度越高，患者术后生存时间越短。比例风险回归模型分析显示，肿瘤部位、临床分期、分级、是否有颈部淋巴结转移及 表达量均与喉癌患者生存时间有关，但均不能作为同时影响患者生存时间的独立因素（.），与既有文献报道一致。声门型喉鳞癌的发展向下会受到弹力圆锥的限制，向上受到喉室的限制，而声门上、下型的限制较少，且声门上型患者因淋巴系统丰富易发生颈部淋巴结转移，故声门上、下型与声门型相比是影响患者生存率的危险因素，且差异可能是由淋巴结转移所致。此外，肿瘤的临床分期与 分期及是否有淋巴结转移密切相关，而 的表达又受到肿瘤临床分期的影响，因此，影响患者生存时间的因素都存在相互影响，对患者预后的影响作用相互重叠，掩盖了彼此的作用，进而导致这些因素均不是影响预后的独立因素。综上，对于喉鳞癌的预后预测有一定的参考意义，但由于其表达与临床分期密切相关，并不是影响喉鳞癌患者生存率的独立危险因素。参考文献 ，（）：，：，：詹启敏，陈杰 细胞周期与肿瘤转化医学 中国肿瘤临床，（）：，（）：，（）：
