1、淡水渔业，2023，53(2):3 11Freshwater Fisheries2023 年 3 月Mar.2023收稿日期:2022-04-19;修订日期:2023-01-12资助项目:珠江渔业资源调查与评估创新团队项目(2020TD10/2020ZJTD-04)第一作者简介:高尚(1994)，女，硕士研究生，专业方向为鱼类分子生态学。E-mail:13215640995163 com通讯作者:陈蔚涛。E-mail:ncuskchenweitao163 com基于 DNA 条形码基因和核基因的美丽小条鳅隐存多样性研究高尚1，2，向登高1，3，李跃飞1，李捷1，陈蔚涛1(1 中国水产科学研究院
2、珠江水产研究所，广州 510380;2 上海海洋大学海洋生态与环境学院，上海 201306;3 贵州大学动物科学学院，贵阳 550025)摘要:为揭示华南地区美丽小条鳅(Micronemacheilus pulcher)的隐存多样性及其地理分布格局，同时为美丽小条鳅的精准管理和保护提供重要理论背景知识，本研究采集了华南地区多个水系 19 个地理群体共计 102 尾美丽小条鳅样本，测定了所有样本的 DNA 条形码标准基因(线粒体 COI 基因)与部分样本的糖基转移酶基因(Glyt 基因)，综合了系统发育分析、遗传距离估算、等位基因网状图分析、物种有效性界定等方法，基于 COI 基因的系统发育结果
3、显示，美丽小条鳅存在两个主要谱系(I 和)，谱系主要由珠江水系、漠阳江水系、南流江水系群体构成，谱系由海南岛的陵水河水系和南渡江水系群体组成。另外，研究发现谱系可以细分为三个严格地理分布的子谱系(-1，-2 和-3)，其中子谱系-1 由珠江水系的西江、北江和南流江水系的群体组成，子谱系-2 和-3 分别由珠江水系的东江群体和漠阳江水系群体组成;谱系可以分为子谱系-1 和-2，分别由陵水河水系群体和南渡江水系群体组成。遗传距离估算发现谱系和之间的遗传距离达到 5 83%，谱系的两个子谱系之间的遗传距离到达 2 92%，大于 2%的 DNA 条形码物种鉴定阈值。基于 Glyt 基因的系统发育分析未
4、获得严格的谱系分化，但是等位基因网状图支持大陆群体和海南岛群体以及海南岛的陵水河水系群体和南渡江水系群体的进化独立性。基于 COI 基因的 ABGD(automatic barcode gap discovery)和 PTP(poisson tree process)分析和联合两个基因的 BPP(bayesian phylogenetics and phylogeography)分析均支持谱系、子谱系-1 和子谱系-2 为三个独立物种，表明美丽小条鳅至少包含三个隐存种。研究结果表明美丽小条鳅的多样性可能被低估，亟需使用形态度量学、更高覆盖度的和多种类型的分子标记来全面系统揭示其隐藏的遗传多样性
5、，为美丽小条鳅全面精准的管理保护提供数据支持。关键词:美丽小条鳅(Micronemacheilus pulcher);DNA 条形码;COI;Glyt;隐存种中图分类号:Q953文献标识码:A文章编号:1000-6907-(2023)02-0003-09美丽小条鳅(Micronemacheilus pulcher)隶属于鲤形目(Cypriniformes)条鳅科(Nemacheilidae)小条鳅属(Micronemacheilus)，是广泛分布在我国华南地区的小型底栖鱼类1。由于受到水利开发、过度捕捞、环境污染等诸多因素的影响，美丽小条鳅的资源量衰退严重，亟需给予关注和保护。运用遗传进化分析
6、手段了解美丽小条鳅的遗传谱系及其空间分布格局对该物种遗传种质资源的保护和管理具有重要实际价值。已有研究表明，小型底栖鱼类扩散能力弱，容易在小范围内形成遗传分化，甚至形成高度分化的遗传谱系或者新种2，3。我国华南地区河流网络复杂，拥有珠江水系(包括东江、西江、北江三大干流)、海南岛诸河流及其周边小型陆封型河流，如南流江、漠阳江等。这些河流虽然相隔的地理位置不大，但却相互被海水或者山脉隔离，极大地限制了鱼类群体之间的迁移扩散。另外，华南地区经历的系列地质事件，如海平面波动、山脉隆升等4，5 也在一定程度上深刻影响着鱼类的进化历史6。鉴于上述背景资料，推测美丽小条鳅可能形成了相互独立的遗传谱系甚至新
7、种。丘城锋等7 和庆宁等8 分别利用线粒体 Cytb 基因和控制区片段发现华南西部及海南岛的美丽小条鳅已经形成了多个遗传谱系。然而，由于早期研究涉及研究区域比较有限，并且仅使用了线粒体分子标记，因DOI:10.13721/ki.dsyy.2023.02.002淡水渔业2023 年此很有必要利用高覆盖度的样本和不同类型基因来重新评估美丽小条鳅在遗传层面上的多样性水平以及是否已经进化成多个物种。DNA 条形码作为分类学中辅助物种鉴定的技术，已被广泛应用于物种鉴定9 11 或隐存种发现的相关研究中12 14。针对脊椎动物类群，DNA 条形码技术主要通过利用线粒体细胞色素 c 氧化酶中 5端约 650
8、 bp 的碱基序列来实现物种的鉴定或者隐存种的挖掘。另外，随着分析方法的改进和完善，越来越多的研究倾向于联合线粒体基因和核基因等多种分子标记进行隐存种的验证2，15，16。因此，本研究通过对华南地区多个水系 19 个站位的美丽小条鳅样本的采集，利用 DNA 条形码基因(COI 基因)和糖基转移酶基因(Glyt 基因)评估美丽小条鳅的进化谱系组成，并验证美丽小条鳅是否存在隐存种，旨在为美丽小条鳅后期的管理和保护提供科学支撑。1材料与方法11样品采集分别于 2017 年 7 月 2020 年 9 月进行采集，在珠江水系(东江、西江、北江)、漠阳江、南流江、海南岛的凌水河和南渡江的 19 个站位(图
9、1)共采集美丽小条鳅样品 107 尾(表1)。剪取每尾样本的少量胸鳍鳍条并保存在 95%的酒精中，带回实验室用以 DNA 提取。表 1样本采集信息Tab 1Sampling information种群编号样品数经纬度所属河流COI 基因序列号Glyt 基因序列号博白BB719 220/109 447南流江OM978446-OM978452ON246276-ON246277从江CJ125 752/108 905西江OM978461ON246283儋州DZ519 417/109 551海南岛OP622543-OP62257OP672395-OP672396柳城LC524 650/109 244西江
10、OM978480-OM978484ON246294清远QY723 657/113 056西江OM978469-OM978475ON246291-ON246292濛江MJ223 471/110 744西江OM978491-OM978492ON246298永福YF524 983/109 993西江OM978542-OM978546ON246318-ON246319韶关SG824 784/113 596西江OM978453-OM978460ON246278-ON246282恭城GC724 829/110 828西江OM978462-OM978468ON246284-ON246290古竹GZ423 5
11、22/114 709东江OM978476-OM978479ON246293鹿寨LZ624 46/109 755西江OM978485-OM978490ON246295-ON246297蒙山MS824 191/110 525西江OM978493-OM978500ON246299-ON246302融安A625 205/109 406西江OM978501-OM978506ON246303-ON246304三都SD625 970/107 861西江OM978514-OM978519ON246306-ON246307水贤SX818 801/109 701海南岛OM978520-OM978527ON2463
12、08-ON246311新丰XF824 047/114 192北江OM978528-OM978535ON246312-ON246315阳春YC622 153/111 805漠阳江OM978536-OM978541ON246316-ON246317榕江J725 896/108 497西江OM978507-OM978513ON246305昭平ZP124 167/110 811西江OM978547ON24632012基因组 DNA 提取、扩增与测序采用高盐法提取基因组总 DNA9。利用通用引 物 FishF1(5-TCAACCAACCACAAAGACATTG-GCAC-3)和Fish1(5-TAGAC
13、TTCTGGGTGGC-CAAAGAATCA-3)10 扩增线粒体 COI 基因 5端约650 bp 的序列。PC 反应扩增体系为 25 L:2 PC mix(0 1 U/L)12 5 L，正反向引物(10mmol/L)1 L，DNA 模板 1 L，最后用 ddH2O 补齐4第 2 期高尚等:基于 DNA 条形码基因和核基因的美丽小条鳅隐存多样性研究图 1采样示意图Fig 1Map of sample sites不同颜色圆圈代表不同遗传谱系，详见图 2。至 25 L。PC 反应条件为:95 预变性 5 min，94 变性 30 s，54 退火 30 s，72 延伸 1 min，30 个循环，最
14、后再 72 延伸 10 min。筛选部分样本进行糖基转移酶基因(Glyt)的扩增和测序。使用引物 Glyt_ F559(5-GGACTGTCMAAGATGACCAC-MT 3)和 Glyt_ 1562(5-CCCAAGAGGTTCTT-GTTAAGAT-3)11 对 Glyt 基因进行扩增。PC 反应扩增提取与 COI 基因相同，反应条件为:95 预变性 5 min，95 变性 30 s，55 退火 1 min，72 延伸 1 5 min，35 个循环，最后再 72 延伸10 min。扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测后送往测序公司进行双向测序。13数据处理与分析测序获得的 DNA 序列采用
15、Lasergene v7 1软件包中(DNASTA，Inc，USA)的 Seqman 软件进行人工核查、校正及组装拼接。拼接完成的序列用MEGA 6 06 软件17 进行多重比对，剪切掉冗余片段获得一致序列备用。利用 DnaSP 5.10 18 统计单倍型数，使用 MEGA6 06 软件分析序列特征。选取横纹南鳅为外类群，采用邻接法(Neighbor-Joining，NJ)并基于 Kimura双参数(K2P)模型19 构建所有美丽小条鳅 COI 基因序列邻接关系进化树。另外，使用 axML-VI-HPC20 和 MrBayes 3 1 221 构建基于美丽小条鳅COI 基因单倍型数据和 Gly
16、t 基因等位基因型数据的系统发育树。利用 MMODELTEST 2 3基于赤池信息量原则(AIC)选择最优的核苷酸替代模型(COI:GT+G;Glyt:K80)。最大似然树自展重复数设置为 1 000 次;贝叶斯系统发育树运算一共运行了2 108代，每1 000 代取样1 次，舍弃前25%的运行代数。同时基于不同基因类型，分别利用 MEGA估算了不同进化谱系内部和不同进化谱系之间的遗传距离。考虑到核基因进化速率慢的特点，本研究利用 POPAT 1 7 2绘制了不同谱系之间的等位基因网状图22，用以查看不同线粒体谱系之间在核基因水平上的进化关系。核基因数据的分型在DnaSP 5 10 软件中运行。利用三种方法对美丽小条鳅物种是否存在隐存物种进行界定。首先，采用 Automatic Barcode GapDiscovery(ABGD)23 基于 K2P 和 JC69 距离模型查看了美丽小条鳅的可操作分类单元(Operational tax-onomic unit)数目。此外，基于单倍型数据构建的最大似然树，使用 Poisson Tree Process(PTP)24 算法评估美丽小条鳅有效
