1、第 30 卷第 2 期2023 年 4 月海南热带海洋学院学报Journal of Hainan Tropical Ocean UniversityVol 30 No 2Apr 2023收稿日期:2023 01 06第一作者:黎瑞珍，女，海南乐东人，副教授，研究方向为化学分析、中学化学教学研究。分光光度法测定火龙果中花青素的含量黎瑞珍1，吴丽1，2，刘美然1，吉月芸1，周巧明1，杨玉霞1，符心雨1(1 海南热带海洋学院 理学院，海南 三亚 572022;2 海南鑫开源医药科技有限公司，海口 570312)摘要:采用紫外可见分光光度法测定火龙果中花青素的含量。通过单因素法考察显色剂混合体积比、水
2、浴温度、缓冲溶液 pH 和水浴时间等样品前处理条件对花青素吸光度的影响，并经正交试验优化以上处理条件。结果表明，样品前处理的最优条件为:显色剂(香兰素甲醇溶液与盐酸甲醇溶液)混合体积比 1 0 9、水浴温度 28、缓冲溶液 pH 4 6、水浴时间 23 min;测得红心火龙果的果皮、果肉与白心火龙果的果皮、果肉中花青素的含量分别为7 010、6 843 mg(100 g)1与 2 121、0 821 mg(100 g)1，相对标准偏差范围为 0 03%0 68%，精密度高。关键词:火龙果;前处理条件;花青素含量;分光光度法;正交试验中图分类号:O657 32;S667 9文献标识码:A文章编号
3、:2096 3122(2023)02 0115 07DOI:10 13307/j issn 2096 3122 2023 02 140引言花青素是类黄酮代谢产物，溶于极性溶剂，属天然水溶性色素，具有很高的营养价值和药理功效1 2。天然花青素植物分布广泛，容易采集，具有成本低、安全性高等特点。花青素参与植物各个发育时期，在多个部位中起到调节作用，调控植物生长发育过程3。此外，花青素还具有清除自由基4、抗肿瘤5、抗炎6、抗氧化7、抗干旱和抗低温抗病虫害8 等作用。火龙果在广东、云南和海南等地均有分布9。海南培植的火龙果富含花青素，产量与营养价值高，是良好的天然色素来源，具有较好的综合开发利用前景1
4、0。本研究以海南培植的红心火龙果与白心火龙果为研究对象，采用紫外可见分光光度计检测火龙果中花青素的含量。通过单因素法考察显色剂(香兰素甲醇溶液与盐酸甲醇溶液)混合体积比、水浴温度、缓冲溶液 pH 和水浴时间等样品前处理条件对测试火龙果中花青素含量的影响，并采用正交试验法优化以上 4 种样品前处理条件。在最优条件下测定红心火龙果与白心火龙果的果皮、果肉中花青素的含量，并比较两者的差异，为海南本地火龙果的综合开发利用提供参考。1 材料与方法1 1 材料与试剂海南培植的新鲜红心火龙果与白心火龙果购自三亚市荔枝沟市场。花青素分析对照品(98%，分析纯，上海麦克林生化科技有限公司);甲醇(99 5%，分
5、析纯，西陇科学股份有限公司);盐酸(分析纯，西陇科学股份有限公司);二水合柠檬酸二钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司);一水合柠檬酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司);香兰素(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。1 2 实验仪器U-3900 紫外可见分光光度计(日本株式会社日立高新科技科学那珂事业所);KQ-250DE 数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);HH 恒温水浴锅(江苏中大仪器科技有限公司);JYL-C022 粉碎机(九阳股份有限公司);BPG-9140A 精密鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司);AE224C 电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司);SWC-LGe 自
6、冷式凝固点测定仪-制冷系统(南京桑力电子设备厂);TGL-15B高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂);PHS-25pH 计(上海仪电科学仪器股份有限公司);TopPette 移液器 美瑞泰克科技(天津)有限公司。511第 30 卷第 2 期海南热带海洋学院学报1 3 实验方法1 3 1 果皮和果肉的预处理将红心火龙果与白心火龙果分别去除果皮上的绿色部分后，将果皮放入粉碎机碎裂，平滑地敷在表面皿上，在 60 烘干 2 h，粉碎后过 80 目筛，备用。将红心火龙果和白心火龙果的果肉分别放入粉碎机中粉碎，将其平滑地敷在表面皿上，在 60 下烘干 24 h 后粉碎，过 80 目筛，备用。1 3 2 最
7、大吸收波长的选择采用紫外可见分光光度法测定火龙果中花青素的含量，首先要选择其最大吸收波长。取 1 0 mL 浓度0 1 mgmL1的花青素标准溶液，加 5 0 mL 混合显色剂(2%香兰素甲醇溶液与 8%盐酸甲醇溶液体积比1 1)11 13，加甲醇定容到 100 mL，避光反应 30 min，在波长为 350 700 nm 处扫描，绘制吸收光谱14，获得花青素最大吸收波长为 492 5 nm(图 1)。0.00吸光度0.050.100.150.200.250.300.350.40350400450500550600650700波长/nm图 1花青素标准溶液的紫外吸收光谱1 3 3 标准曲线的绘
8、制取 0 25、0 50、0 75、1 00、1 25 和 1 50 mL 浓度 0 1mgmL1的花青素标准溶液，分别加入 5 0 mL显色剂，加甲醇定容到 100 mL，稀释成 0 25、0 50、0 75、1 00、1 25 和 1 50 gmL1的花青素标准溶液，在 28 水浴温度反应 23 min 后测其在紫外可见光最大吸收波长 492 5 nm 处的吸光度，并绘制标准曲线(图 2)，其线性方程为 y=0 206 74x 0 000 047 62，R2=0 999 8。0.000吸光度0.0500.1000.1500.2000.2500.3000.3500.400y=0.20674x
9、-0.00004762R2=0.99980.00.20.40.60.81.01.21.41.6花青素含量/（g mL-1）图 2花青素含量与吸光度关系的标准曲线1 3 4 花青素含量的测定取0500 3 g 果皮粉置于50 mL 离心管中，加入25 mL 浓度5%的柠檬酸溶液 15，在55 下超声30 min，放凉后，以6 000 rmin1离心20 min，留取上清液 16。吸取6 mL 上清液放入棕色容量瓶中，加入混合体积比 109 的显色剂5 mL 和3 mL 缓冲溶液(pH 4 6)，在28 下水浴反应23 min 得到经前处理好的果皮测试样品，采用紫外可见分光光度计测定其吸光度，并依
10、据标准曲线(图 2)获得果皮中花青素的含量。611黎瑞珍等:分光光度法测定火龙果中花青素的含量2023 年第 2 期取 1 000 5 g 果肉粉末，加 10 mL 浓度 80%乙醇，超声 20 min，以 6 000 rmin1离心 20 min17，留取上清液。取6 mL 上清液，加入混合体积比为1 0 9 的显色剂5 mL 和3 mL 缓冲溶液(pH 4 6)，在28 下水浴反应 23 min 得到果肉测试样品，测定其吸光度，并依据标准曲线(图 2)获得果肉中花青素的含量。1 3 5 正交试验通过单因素法考察显色剂混合体积比、水浴温度、缓冲溶液 pH 值和水浴时间等样品前处理条件对测试花
11、青素吸光度的影响，分别获得适宜的样品前处理条件。在此基础上，采用 L9(34)正交试验确定以上 4种样品前处理最佳条件。2 结果与分析2 1 显色剂混合体积比对吸光度的影响2%香兰素甲醇溶液与 8 0%盐酸甲醇溶液按一定体积比混合即得显色剂。在缓冲溶液 pH 为 4 2、水浴温度 35、水浴时间 15 min 的样品前处理条件下，采用显色剂混合体积比分别为 1 0 25、1 0 5、1 0 75、1 1、1 1 25 和 1 1 5 处理红心火龙果果皮，并测定其花青素的吸光度，考察显色剂混合体积比对吸光度的影响(图 3)。显色剂混合体积比0.3600.3700.3800.3900.4000.4
12、10吸光度010.2510.510.751111.2511.5图 3显色剂混合体积比对吸光度的影响从图 3 可知，当显色剂混合体积比为 1 1 时，测得的吸光度达到最大;当显色剂混合体积比大于 1 1时，吸光度随之降低。因此，在显色剂体积比为 1 1 时测试为宜。2 2 水浴温度对吸光度的影响在缓冲溶液 pH 为 4 2、显色剂混合体积比 1 1、水浴时间 15 min 的样品前处理条件下，采用水浴温度分别为20、25、30、35、40 和45 处理红心火龙果果皮，并测定其花青素的吸光度18，考察水浴温度对吸光度的影响(图 4)。水浴温度/0.250吸光度150.2600.2700.2800.
13、2900.3000.31020253035404550图 4水浴温度对吸光度的影响711第 30 卷第 2 期海南热带海洋学院学报从图 4 可知，水浴温度小于 30 时，随着温度升高，吸光度值增大，在 30 时达到最大值，测试效果最好;此后再升高温度，吸光度值随之下降。因此，水浴温度 30 为宜。2 3 缓冲溶液 pH 对吸光度的影响花青素在酸性条件下较为稳定，利用缓冲溶液控制样品检测体系的酸碱度。在显色剂混合体积比 1 1、水浴温度为 35 、水浴时间 15 min 的样品前处理条件下，采用缓冲溶液 pH 分别为 3 0、3 6、4 2、4 8、5 4、和 6 0 处理红心火龙果果皮，并测定
14、其花青素的吸光度19，考察缓冲溶液 pH 对吸光度的影响(图 5)。吸光度0.3000.3100.3200.3300.3400.3500.3600.3702.403.003.604.204.805.406.006.60缓冲溶液pH图 5缓冲溶液 pH 对吸光度的影响从图 5 可知，当缓冲溶液 pH 为 3 0 至 4 8 时，吸光度逐渐增大;然而，当缓冲溶液 pH 为 4 8 至 6 0时，吸光度逐渐降低。可见，缓冲溶液 pH 为 4 8 较适宜，此时吸光度最大。2 4 水浴时间对吸光度的影响在显色剂混合体积比 1 1、缓冲溶液 pH 4 2、水浴温度 35 的样品处理条件下，采用水浴时间分别
15、为15、20、25、30、35 和 40 min 处理红心火龙果果皮，并测定其花青素的吸光度，考察水浴时间对吸光度的影响(图 6)。吸光度100.2500.2600.2700.2401520253035404550水浴时间/min0.280图 6水浴时间对吸光度的影响从图 6 可知，水浴时间从 15 min 增至 25 min 时，吸光度逐渐增加;在水浴时间为 25 min 时，测得的吸光度值最大;而水浴时间从 25 min 增至 40 min 时，吸光度值逐渐减小。可见，适宜的水浴时间为 25 min。2 5 样品前处理条件的优化综合单因素实验 2 1 2 4，可以获得 4 个适宜的样品前处
16、理条件。通过对以上 4 种条件进行 L9(34)811黎瑞珍等:分光光度法测定火龙果中花青素的含量2023 年第 2 期正交试验，获得测定火龙果花青素含量的最佳样品前处理条件(表 12)。表 1正交试验因素水平水平水浴温度/水浴时间/min缓冲溶液 pH显色剂混合体积比128234 61 0 0 9230254 81 0 1 0332275 01 0 1 1表 2正交试验结果序号因素水浴温度/水浴时间/min缓冲溶液 pH显色剂混合体积比吸光度111110 370212220 360313330 357421230 334522310 329623120 330731320 321832130 312933210 316K11 0871 0251 0121 015K20 9931 0011 0101 011K30 9491 0031 0071 003k10 3620 3420 3370 338k20 3310 3340 3370 337k30 3160 3340 3360 334R0 0460 0080 0010 004从表 2 可以看出，样品前处理条件从高至低的影响顺序为:水浴温度、
