1、文章编号:1009-6094(2023)04-1250-11改性生物炭固定枯草芽孢杆菌对黑臭水体中污染物的处理效果研究*唐玉兰，马悦，何亚婷，王晓华(沈阳建筑大学市政与环境工程学院，沈阳 110168)摘要:以核桃壳生物炭为载体，通过吸附法和包埋法固定从黑臭水体底泥中分离出的具有降解功能的枯草芽孢杆菌N3，考察固定化体对模拟黑臭水中 NH+4 N 和化学需氧量(COD)的去除效果并研究降解机理。通过扫描电子显微镜(SEM)、傅里叶变换红外光谱(FT I)等检测手段发现，吸附法制备的固定化体(XF K)比包埋法制备的固定化体(BM K)的表面形态及官能团更有益于吸附微生物和降解污染物。在 90
2、h 内，XF K 对 NH+4 N 和 COD 的降解率分别达到 88.46%和 82.41%，降解效果明显优于 BM K。XF K 的最佳作用条件为 pH=7、温度 35、投加质量浓度0.01 g/mL。准二级动力学模型可以更好地描述 XF K 对NH+4N 和 COD 的吸附过程;XF K 对 NH+4 N 的吸附更符合 L 型模型，对 COD 的吸附更符合 F 型模型。关键词:环境工程学;固定化;改性生物炭;枯草芽孢杆菌;氨氮;化学需氧量(COD)中图分类号:X522文献标志码:ADOI:10.13637/j issn 1009-6094.2022.0254*收稿日期:2022 02 2
3、1作者简介:唐玉兰，教授，博士，从事流域环境治理和修复研究，tyl198037163 com。基金项目:沈阳市科技局项目(20 206 4 07)0引言近年来，随着“水十条”的推进，城市黑臭水体已有很大改善。但时有返黑返臭现象，农村黑臭水体治理形势严峻。根据农村人居环境整治村庄清洁行动方案，2025 年要基本消除我国农村黑臭水体1。因此，黑臭水体治理压力较大。目前治理黑臭水体的方法主要有 3 种，分别是物理法、化学法和生物法。其中生物法治理成本相对低，且对河道生态环境具有长期修复效果。但向河道中直接投加菌剂存在微生物易流失、存活率低等缺点。固定化微生物技术通过将游离微生物固定在载体上，可以解决
4、易流失的问题2。1959 年，Hattori 等3 最先利用树脂为载体吸附固定大肠杆菌;1982 年，黄武华等4 较早在实验室内用琼脂固定污泥，并从活性污泥中分离出的一株降解菌处理苯酚。1967 年，Parkhurst 等5 首次肯定了微生物在活性炭上生长的有利性，因此含炭材料常被用作固定化载体。不少学者在试验中发现，以生物炭为载体固定微生物，不仅可以促进微生物生长，还可以提高微生物对污染物的降解能力6 9。核桃壳作为常见废弃物，具有发达的孔隙结构和丰富的官能团10，是近年来生物炭制备中常见的原材料。黄晓龙11 发现核桃壳生物炭对氨氮的吸附能力优于花生壳生物炭和玉米秸秆生物炭，能够达到 3.3
5、5 mg/g。本文以改性核桃壳生物炭为载体，分别用吸附法和包埋法固定从黑臭水体底泥中筛出具有降解性能的菌株，以考察两种固定化体对黑臭水体中常见污染物 NH+4 N 和 COD 的降解性能并研究吸附法固定菌株的降解原理，为微生物法治理沈阳市农村黑臭水体提供理论参考与实践依据。1材料与方法1.1模拟黑臭水的配制根据沈阳市农村黑臭水体的水质指标，称量:5.00 g 蛋白胨(A，天津市瑞金特化学品有限公司);3.50 g 牛肉膏(A，国药集团试剂有限公司);0.85 g 尿素(A，国药集团试剂有限公司);2.30 gNaCl(A，国药集团试剂有限公司);0.40 g KCl(A，国药集团试剂有限公司)
6、;0.30 g CaCl2(A，国药集团试剂有限公司);0.30 g MgSO4(A，国药集团试剂有限公司);11.50 g K2HPO4(A，国药集团试剂有限公司);1.50 g KH2PO4(A，国药集团试剂有限公司);0.10 g 磺胺酸(A，天津市瑞金特化学品有限公司)、0.10 g 柠檬酸铁(A，国药集团试剂有限公司)和2.00 g 实际黑臭河流底泥12。将以上各种物质加入桶内，加水稀释至 15 L，加盖密封。在 32 下静置，7 d 后水体变黑，模拟黑臭水的配制完成，备用。1.2生物炭的制备及改性将农业废弃物核桃壳冲洗干净，于60 烘干12h。经粉碎、过2 mm 筛后，在700 下
7、烧制2 h，获得改性前的生物炭载体(BC)。用 5.5 mol/L HNO3(A，国药集团试剂有限公司)对 BC 进行改性，获得改性生物炭(HBC)。1.3菌株的筛选及菌悬液的制备取 20.00 mL 黑臭水体底泥的泥水混合物，接种至 LB 液体培养基中，用纱布封口，进行富集培养(30，150 r/min)。3 d 后取该培养基的上清液，继续接种至新鲜 LB 液体培养基中，连续接种 30521第 23 卷第 4 期2023 年 4 月安全 与 环 境 学 报Journal of Safety and EnvironmentVol 23No 4Apr，2023次。利用稀释涂布法分离出 3 株生长
8、较快的土著菌，将 3 株菌株分别命名为 N1、N2 和 N3。将菌株通过平板划线法分离纯化后，接种至 LB 液体培养基中，富集培养(30，150 r/min)至 OD600为 1.0。在 5 000 r/min 条件下离心 15 min，弃去上清液，收集菌体。用无菌水将湿菌体配制成菌悬液备，备用。1.4固定化体的制备吸附法:称取 1.00 g 改性核桃壳生物炭置于500 mL 锥形瓶中，高压灭菌后加入 200.00 mL 菌悬液，调节 pH 值为 7。将锥形瓶置于恒温振荡培养箱(GHP 9270，上海科辰实验设备有限公司)中振荡培养 24 h(30、150 r/min)，取出后静止过滤。用无菌
9、生理盐水(0.9%，石家庄四药有限公司)清洗 3 次，得到吸附法制备的固定化体，记为 XF K。包埋法:将基于 2.00 g 生物炭制备的 XF K加入 40.00 mL，20 g/L 的海藻酸钠(A，国药集团试剂有限公司)中，混合后装入到注射器中，并向20 g/L CaCl2(A，国药集团试剂有限公司)溶液中逐滴加入，静置交联 5 h 后用无菌水淋洗过滤，得到包埋法制备的固定化体，记为 BM K。1.5固定化体对模拟黑臭水的降解试验分别将 5.00 g 生物炭、5.00 mL 游离菌菌液、基于 5.00 g 生物炭制备的 XF K 和 BM K投加到 500.00 mL 模拟黑臭水中。在恒温
10、振荡培养箱(30 、150 r/min)中培养，分别于 1 h、2h、4 h、8 h、18 h、24 h、30 h、42 h、54 h、66 h 和 90h 取样，检验几种材料对污染物的处理效果并进行比较。1.6固定化体降解性能的影响因素试验1.6.1投加质量对固定化体吸附量的影响试验分别将 0.50 g、1.00 g、1.50 g、2.00 g、2.50 gXF K 投加到 100.00 mL 模拟黑臭水中，在恒温振荡培养箱(30 、150 r/min)中培养 3 d，取样。1.6.2pH 值对固定化体吸附量的影响将 1.00 g XF K 投加到 100.00 mL 模拟黑臭水中，分别将
11、pH 值设为 3、5、7、9、11，在恒温振荡培养箱(30、150 r/min)中培养 3 d，取样。1.6.3温度对固定化体吸附量的影响将 1.00 g XF K 投加到 100.00 mL 模拟黑臭水中，分别将温度设为 15、25、35、45、55，在恒温振荡培养箱(150 r/min)中培养 3 d，取样。1.7降解动力学和吸附等温线的拟合降解动力学试验:将试验数据分别与准一级方程和准二级方程拟合，见式(1)和(2)。Qt=Qe(1 eK1t)(1)Qt=K2Qet1+K2Qet(2)式中Qt为 t 时刻吸附质量比，mg/g;Qe为平衡吸附质量比，mg/g;t 为时间，min;K1为准一
12、级反应速率常数，min 1;K2为准二级反应速率常数，g/(mg min)。等温吸附试验:将试验数据分别与 Langmuir 模型和 Freundlich 模型拟合，见式(3)和(4)。Qe=KLeQm1+KLe(3)Qe=Kf1ne(4)L=11+KL0(5)式中Qe为平衡吸附质量比，mg/g;e为吸附平衡质量浓度，mg/L;Qm为最大吸附质量浓度，mg/g;Kf为 Freundlich 常 数，(mg/g)(L/mg)1/n;KL为Langmuir 常数，mg/L;n 表示吸附的强度;L为平衡常数;0为初始质量浓度，mg/L。1.8检测设备和检测方法NH+4 N、COD 的质量浓度检测设备
13、为紫外分光光度计(SP 752，上海光谱仪器有限公司)，检测方法为 GB 118921989 和 GB 74791987。材料表面结构分析采用扫描电子显微镜(S4800 型扫描电镜，日本 HIECH 公司)，材料元素量的检测设备为 元 素 分 析 仪(Vario EL，德 国 Elementar 公司)，材料官能团分析采用傅里叶红外光谱仪(Nicolet iS20，美国 Thermo Scientific 公司)，比表面积和孔隙分布分析由全自动比表面积和孔径分布分析仪(ASAP2460，澳大利亚 AntonPaar 公司)进行测定。2结果与讨论2.1改性生物炭的制备及理化性质为了分析生物炭改性
14、前后理化性质，对改性前后生物炭的比表面积及元素组成进行检测，见表 1。由表 1 可知，改性后的生物炭的比表面积是改性前的 4 倍多，表明改性可以提升生物炭的吸附能力。C、H、O 元素含量均有上升，表明改性使生物炭的含氧基团增加，结构更加稳定。15212023 年 4 月唐玉兰，等:改性生物炭固定枯草芽孢杆菌对黑臭水体中污染物的处理效果研究Apr，20232.2微生物的降解性能和分子鉴定2.2.1微生物的降解性能分离得到的菌株 N1、N2、N3 对 NH+4N 3 d 内降解率分别为 52.65%、65.18%、66.65%，对 COD 3 d 内降解率分别为 69.23%、72.67%、72.
15、15%。因此，选取N3 作为目标菌株制备固定化体。将1.00 mL N3 菌液投加到初始 NH+4N 质量浓度为38.40 mg/L，COD 质量浓度为101.72 mg/L 的100 mL 模拟黑臭水中，每隔12 h 取样，试验结果见图1。图 2N3 的 16S rDNA 的序列系统发育树Fig 2Sequence phylogenetic tree of 16S rDNA of N3表 1改性前后生物炭的基本理化性质Table 1Basic physial and chemical properties of biochar before and after modification状态产
16、率/%比表面积/(m2g1)pH元素质量分数/%CHON改性前改性后4612.2787.8664.231.7115.142.1751.6987.5166.182.2418.281.57由图1 可知，菌株 N3 对污染物的降解率随时间的增加先升高，后逐渐趋于稳定，并在 48 h 左右达到平衡，此时对 NH+4 N、COD 的降解率分别为66.65%、72.23%。在 0 24 h，菌株 N3 对污染物的降解速率较快，COD 的质量浓度由 101.72 mg/L 迅速降至 50.23 mg/L，NH+4 N 的质量浓度由 37.4mg/L 降至18.73 mg/L;在60 h 左右，COD 质量浓度降至 27.49 mg/L，达 IV 水标准，水质指标由重度黑臭转变为轻度黑臭。2.2.2微生物分子鉴定用 ContigExpress 拼接测序结果，并去除两端不准的部分，将拼接好的序列在 NCBI 数据库中进行比对，采用的是 nt 数据库和 NA 数据库，鉴定结果见图 2。选择同源度最高的物种，从而确定菌株 N3图 1菌株 N3 对污染物的降解性能Fig 1Degradation of pol
