1、 ：文章编号：（）单细胞测序技术在植物中的应用研究进展张在宝，赵紫微，张佩欣，叶凡，罗天（信阳师范学院 生命科学学院，河南 信阳 ）摘要：为了探究单细胞测序技术在植物中的应用，综述了单细胞测序技术发展概况、原理、测序技术流程及其在植物中的应用研究，为今后系统全面地开展植物单细胞测序提供理论依据。关键词：单细胞测序技术；基因组；转录组；植物中图分类号：文献标识码：开放科学（资源服务）标识码（）：o o o o o，（，）：，o ：；引言传统的测序方法只能反映细胞的平均表达数据，并不能提供单个细胞之间的异质性信息。而单细胞测序技术可以弥补传统测序方法的不足，如识别单个细胞、发现新细胞、理解植物发育
2、过程中细胞的独特性功能等。单细胞测序技术不仅能够揭示细胞群体与基因间的调控机制，同时能追踪不同类型细胞在发育过程中的轨迹，并详细分析细胞水平上的基因表达情况。相对于动物中的大量单细胞的研究工作，植物单细胞的工作刚开始起步。单细胞测序技术在植物研究中具有巨大的潜力。本文详细阐明单细胞测序技术的发展概况、原理、测序技术流程及其在植物中的研究应用，并分析单细胞测序技术的前景和挑战。单细胞测序技术发展概况以 年 等开发的第一代测序技术为起点，人类正式迈入基因组学时代。第一代测序技术的主要特点是测量序列读长可达，精确度接近 ，但因测序价格高、通量低等方面的不足，未能被大规模应用。为解决第一代测序技术存在
3、的问题，经过科研人员长期探索改进，第二代测序技术被成功开发。第二代测序技术在提高测序速度和精确度的基础上，降低了测序过程中花费的成本，但因其序列读长较短，新引入的聚合酶链反应（，）导致基因组中出现过度扩增区和欠扩增区，因此覆盖率较低，并且具有系统偏向性。随着科学技术水平的发展进步，第三代测序技术在完美避开前两代测序技术缺点的基础上，将其优点进行了融合。第三代测序技术不需要进行任何基因组或转录组的扩增，只利用单个细胞直接进行测序，避免了 过程中的扩增错误，在提高序列读长和测序速度的同时，成本也被降低。然而，真核多细胞生物的细胞具有固有的异质性，直接对细胞群体进行测序分析显示出的结果只是所有细胞的
4、平均表达信号，而一些异质性细胞的表达情况却被掩盖和忽略。许收稿日期：；修订日期：；通信联系人，：基金项目：国家自然科学基金项目（）作者简介：张在宝（），男，山东潍坊人，副教授，博士，主要从事植物生殖发育与功能进化研究。信阳师范学院学报（自然科学版）第 卷第期 年月 多研究表明，即使在十分相似的细胞种类中，基因表达也是具有差异化的。为了完全了解和辨别复杂细胞群的异质性，必须对大量单个细胞进行测序分析。以基因组学、转录组学和表观基因组学为基础的测序技术更多地集中于单个细胞的研究，而非细胞群体的研究。单细胞测序技术可以高精度地发现细胞存在的异质性及罕见细胞，揭示复杂组织中细胞类型的发展和分化，评价单
5、个细胞之间的基因表达差异。单细胞测序技术原理单个细胞是构成大部分生物体最小的功能通用单位，基因表达在单个细胞或细胞间受调控。单细胞测序是将获得的样品细胞分离，对获得的单细胞基因组和转录组进行测序分析，以用于检测单核苷酸变异（）、结构变异、基因融合甚至表观遗传学中的 甲基化状态等，从而在单细胞水平上获取所需的生物学信息。单细胞全基因组测序技术单 细 胞 全 基 因 组 测 序 技 术（，）的 出 现 和 发展，在单细胞分辨率下揭示了生物样本中的基因组异质性。技术利用单细胞全基因组扩增（）方法，定义了表述这些方法性能的关键参数，包括基因组覆盖率、一致性、不可复制率、等位基因退出率、调用单核苷酸变异
6、的假阳性率、调用拷贝数变异的能力等，利用这些参数对多个单细胞进行深度测序。单细胞转录组测序技术单细胞转录组测序技术又被称为单细胞 测 序 技 术（，），是指获得单个细胞内的绝大多数基因表达信息，用于分辨不同细胞类型的转录组特征，进而揭示分化发育过程中其生物学功能、表型等的基因调控网络及它们在多细胞组织中的作用。单细胞转录组测序可分为以下两种方式：一是 分子进行反向转录为 ，通过 扩增或线性扩增后在二代测序平台的基础上进行转录组数据分析；二是通过单分子测序技术直接对 进行测序分析。单细胞测序技术流程单细胞测序技术包括单个细胞的裂解与分离、遗传物质扩增、文库构建及测序、数据的可视化分析等。单个细胞
7、的裂解与分离流式细胞术在目前普遍存在的不同种类的流式细胞仪中，应用最广泛的是荧光激活细胞分选（）系统。每个细胞都具有不同的物理、化学或光学特性，正是由于这些性质，才将不同的细胞区分开来。当细胞流以较高的速度通过激光束时，在下游使用光学检测器可通过上游产生的激光束来捕获特定细胞信号。经过分析，细胞悬浮在一个由小通道组成的封闭系统中，在压力的驱动下细胞流通过直径为微米级的小喷嘴，随后成为具有前进动力的液体射流。利用电磁波或超声波等振动力量，该射流成为分散的飞行液滴流。通过利用带电板的偏转吸引携带特定细胞的液滴，最终获取的液滴被收集至通常为管或微孔板的容器中。该技术可对具有差异化的细胞进行快速分选，
8、并且提供了较高的准确性。激光捕获显微切割法激光捕获显微切割（）是一项先进的技术，用于从大部分固体组织样本中分离单个细胞或细胞室。通过目视靶细胞或隔室进行识别后利用显微镜观察组织进行切片。实验员在屏幕上画线来选定要切断的部分。沿着所画的线，激光切割组织从而获得所需要的单细胞。该技术需保持细胞处于悬浮状态并具有活性，操作较为复杂，在操作过程中较易出现失误，导致不能完全确定所需细胞是否真的被转移到基质中或被转移的细胞是否纯净无杂质，因此获得的单细胞纯度较低。微流控法微流控技术是利用油包水来进行单细胞的分离。首先，通过控制液滴的流动速度来捕获单个细胞。然后，利用单细胞隔离系统，基于喷墨的方式进行单细胞
9、打印。这种单细胞打印机（）使用成像系统和自动物体识别算法来检测微流控分配器芯片中的细胞，该芯片可以产生类似喷墨打印机的液滴。在芯片的喷嘴中对细胞进行分类，然后在微滴（直径）内喷射，以沉积到各种基板上，不含细胞或多个细胞的液滴在飞行过程中通过真空抽吸转向废物容器。该技术不仅能快速、准确地从样品中分离出单个细胞，而且还可以在细胞样本和试剂的体积非常小的情况下运行。从经济角度来看，该技张在宝，赵紫微，张佩欣，等 单细胞测序技术在植物中的应用研究进展术对于稀有细胞应用是十分有利的。遗传物质扩增单个细胞遗传物质的含量很低，并不能满足后续进行测序分析的要求，因此需要先对单细胞遗传物质扩增，该步骤是测序的必
10、要条件。遗传物质扩增 主 要 分 为 全 基 因 组 扩 增（，）和 全 转 录 组 扩 增（，），扩增的目的是得到均匀性、完整无损的 。单细胞全基因组扩增技术）简并寡核苷酸引物聚合酶链反应（，）的原理是使用简并引物，在 端包含一个随机六碱基序列，在 端包含一个固定序列。对于初始扩增，引物在低退火温度下与 模板结合。然后在升高的温度下实现钢绞线延伸。扩增的第二阶段，在较高的退火温度下，用针对 固定序列的引物扩增先前的产物。引物和聚合酶的浓度直接影响 的结果。已被用于扩增人类的基因组，以进行基因型分析。的不足之处是产生的基因组覆盖率比较低，这与 的指数扩增有关。不同序列之间扩增因子的任何微小差异
11、都会呈指数级放大，导致基因组中存在过度扩增区和欠扩增区，因此覆盖率较低。）多 重 置 换 扩 增（，）使用的引物为随机六聚体，并引入一种 聚合酶，该酶具有强链置换活性，且由于其 端的特性，聚合酶具备很高的复制保真度。在恒定温度的条件下能延伸随机引物并产生分支结构，这些结构被其他引物延伸并最终形成多分支结构。很好地解决了 存 在的基因组 覆 盖率 低的 问 题。但 是，与 相同，同样对 进行指数倍扩增，这导致序列依赖性偏倚，导致某些基因组区域的过度扩增和其他区域的欠扩增。）多次退火环状循环扩增（，）是 和 完美结合的一项技术，其技术原理为当温度降到 时，引物 端个随机核苷酸、端的 个共同核苷酸可
12、以与模板均匀杂交。在反应开始时，当温度升高至 时，制作长度可变为 的半放大器。半放大器从模板（时）上熔化，全放大器由互补端制成，当温度降低至 时会形成发夹，阻止其进一步放大。这个循环重复 次。前几个周期的准线性放大对于避免因指数放大而加剧的序列依赖性偏差至关重要。使用热稳定 聚合酶，该酶具有链置换活性。在这一重要的预扩增阶段之后，经过 对完好无损的环形扩增子进行指数级扩增，产生下一代测序所需的 量。该技术的关键不在于复制出多少基因组，而是只对所需要的原始基因组 进行扩增，并对扩增出来的产物进行保护。该方法具备准线性放大的特点，减少了因指数放大而加剧的序列依赖性偏差。单细胞全转录组扩增）在低渗溶
13、液中裂解每个细胞，并使用寡核苷酸（）引发和智能模板转换技术将聚（）转化为全长 ，随之进行 个周期的 预扩增，将 模板转换技术用于生成全长 ，并且在初始 合成步骤后仅进行 个 周期。将扩增后得到的 进行标准 测序文库的构建。与以前的单细胞转录组方法相比，显著提高了阅读覆盖率。）是在 技术的基础上开发应用的。其技术核心是引进莫罗尼小鼠白血病病毒逆转录酶（），是一种新的逆转录酶，具有可进行逆转录（）和模板转换（）等 个 先 天 特 性。模 板 转 换 表 示 在 反应期间到达 模板的端时引入一些未模板核苷酸的能力。这些额外的核苷酸作为辅助寡核苷酸（“模板转换寡核苷酸”，）的对接位点，在其 端携带个核
14、糖鸟苷酸和个锁定核酸（）鸟苷酸。这种特殊的碱基结构对于 和胞嘧啶尾之间的稳定退火起关键性作用，并且是 “切换模板”和使用辅助寡核苷酸作为模板合成 链所必需的。之后 通 过 测 序 技 术 进 行 测 序。与 相比，转录组文库具有更好的检测性、准确性、可扩展性和覆盖率，并且具有较低的成本。）是一种以微流控技术为基础的第 卷第期信阳师范学院学报（自然科学版）：年月单细胞转录组测序技术，允许在全基因组范围内进行检测，同时对数千个细胞进行表达图谱分析。首先，将装有引物和条形码寡核苷酸的凝胶珠与细胞和试剂混合。然后，在微流控接头处与油表面活性剂溶液混合在微流控芯片的一个通道中，细胞与试剂结合形成凝胶珠，
15、从另一个通道中提取凝胶珠。将提取出的凝胶珠溶解以释放其寡核苷酸，在每个液滴内部进行多聚腺苷酸化的 反转录，反转录出的条形码互补（）自身扩增后在进行 扩增，将获取的 构建序列文库并进行 短读测序。平台覆盖细胞的范围更广，更容易在测序过程中检测出罕见的细胞类型，但也存在一定的缺陷，如只能对 端进行读序，需要的活细胞较多且操作过程较复杂。数据的可视化分析为了保证获取数据的准确性及后续分析的可行性，需要对所得数据进行预处理，即删除存在误差的测序数据，该过程为数据分析的前提。经过预处理后的测序数据可进行后续分析，其中前期工作包括两个步骤：降维分析、聚类分析，从而在测序数据中提取所需的生物信息。降维分析是
16、将测序的数据转换为更紧凑、更具合理性的数据集；聚类分析则是将基因表达模式相似的细胞分成不同的组。以上两个步骤完成后则可对数据进行更深层的剖析，如可进行差异化基因表达分析、蛋白互作网络分析等。单细胞测序在植物中的研究与应用植物细胞类型及功能研究将成熟的拟南芥叶片去除毛状体、远轴表皮细胞和保卫细胞后沿中脉切开，加入细胞壁消化酶后获得原生质体，从中获得了 个单细胞转录组，对每个细胞进行了约 次读取深度的测序，并确定了每个细胞中 个基因和 个独特的分子标识。将 个拟南芥叶细胞进行 降维处理，使用 软件的无监督聚类功能识别到了 个细胞簇，这 个簇包括了表皮细胞、保卫细胞、叶肉细胞等叶片的所有主要细胞类型，同时使用代谢途径分析确定了它们的生理性功能和作用，为研究拟南芥叶脉系统及其作用提供了广泛的研究思路 。文献 利用基于 平台的高通量单细胞测序技术，获得拟南芥根细胞原生质体的 个单细胞转录组数据，将每个细胞进行 次测序，每个细胞产生了 个唯一分子标识符和 个表达基因，使用 软件进行无监督聚类识别到了个主要的细胞转录组，发现根的所有主要组织和发育阶段都存在于这些单细胞转录组中。利用单细胞群体中 个已
