1、第 卷第期 年月中 国 海 洋 大 学 学 报 （）：，氮限制条件下链状亚历山大藻 的调控机制解析*祁娟，隋正红*，刘源，朱智梅（中国海洋大学 海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室，山东 青岛 ）摘要：为探索链状亚历山大藻（）在低氮条件下的适应性反应机制，本研究采用结合位点分析法（）比较了链状亚历山大藻氮限制和氮正常条件下组蛋白第三亚基四号赖氨酸的三甲基化（）修饰情况及调控机制，分析结果表明 修饰在低氮条件下调控了跨膜转运蛋白活性，表明在低氮条件下链状亚历山大藻增强了转运体活性来获取外界营养物质。通过 分析发现还富集了植物病原菌相互作用途径和谷胱甘肽代谢途径，表明链状亚 历 山 大藻在 低氮
2、条 件 下，病 原 菌 防 御 和 抗 氧 化 应 激 对 其 生 存 至 关 重 要。此 外 还 发 现 在 低 氮 条 件 下 调控了泛素介导的蛋白质降解和自噬途径来缓解氮的耗竭而响应氮胁迫。关键词：链状亚历山大藻；氮胁迫；组蛋白第三亚基四号赖氨酸的三甲基化；结合位点分析法；表观遗传学；组蛋白修饰中图法分类号：；文献标志码：文章编号：（）：引用格式：祁娟，隋正红，刘源，等氮限制条件下链状亚历山大藻 的调控机制解析中国海洋大学学报（自然科学版），（）：，（）：*基金项目：国家自然科学基金项目（，）资助 （，）收稿日期：；修订日期：作者简介：祁娟（），女，硕士生。：*通讯作者：链状亚历山大藻（
3、）是引发世界沿海水域赤潮的主要优势甲藻种之一。该物种会产生强烈的神经性贝毒毒素，导致贝类中毒，并对环境、经济和人类健康造成严重的损害，因而已引起世界各国的广泛关注。为了解赤潮发生和维持的机制，人们对甲藻赤潮发生过程中的物理、化学和生态特性进行了大量的研究。越来越多的证据表明，人为输入氮到沿海地区造成的富营养化是导致赤潮发生的主要原因之一。氮（）是海洋浮游植物生长和繁殖所必需的常量营养素，是蛋白质、核酸、叶绿素和其他大分子的关键组成成分。缺氮会抑制细胞的生长，改变色素组成，减少光合作用能量的获取，降低光合作用效率，增加浮游植物对紫外线的敏感性和它们抵抗光损伤的能力。因此，浮游植物对环境氮限制的反
4、应能力对于其在海洋中的生存至关重要。所以了解甲藻在不同氮浓度下细胞的特异性反应对于理解赤潮的形成机制具有非常重要的意义。早期对甲藻研究表明，氮影响细胞生长、细胞氮和叶绿素（）含量以及甲藻毒素的产生。此外，氮限制也被认为是某些甲藻孢囊形成的主要触发因素。在多种甲藻中也观察到了由环境中氮的变化引起的蛋白质表达谱的改变，如在缺氮的米氏凯伦藻（）中观察到硝酸盐转运、信号转导、氨基酸代谢、修复和溶血素的高表达。因此，深入研究氮限制条件下甲藻对低氮环境的适应机制有助于揭示甲藻水华的形成机制。组蛋白在甲藻中是一种异常特殊的存在，甲藻中的组蛋白并不像在其他真核生物中一样参与核小体的组装。组蛋白在甲藻中存在的作
5、用和意义到目前为止仍不完全清楚，而在本研究前期发现，在链状亚历山大藻培养条件转录组中存在一些与表观遗传修饰相关基因，如甲基化转移酶，去甲基化酶基因，且在低氮表达谱数据中部分表现出较高的表达水平，而组蛋白修饰已被证明参与植物几乎所有的生长发育过程，包括生物和非生物胁迫，对环境的响应，细胞增殖和分化等，意味着组蛋白甲基化修饰的调控可能对中国海洋大学学报 年链状亚历山大藻生长或环境响应等具有特殊的意义。在链状亚历山大藻转录组数据中含有 结构域的组蛋白赖氨酸甲基转移酶（主要催化 赖氨酸上的组蛋白修饰）的基因高达 个，组蛋白甲基化修饰是在特定组蛋白甲基转移酶作用下完成的，组蛋白甲基转移酶的存在数量以及表
6、达量变化是影响组蛋白甲基化类型及其修饰水平变化的一类重要因素；其次，在本课题组以往研究中检测了包括 、与 等多个位点在内的组蛋白 甲基化修饰及乙酰化和磷酸化在内的各种修饰类型，发现 修饰水平较高；最后，因为链状亚历山大藻基因组巨大且复杂，本文作者拟采用亲缘物种基因组来进行后续比对，而在所有已研究的组蛋白修饰中，只有 修饰的保守性最高，在采用近缘物种基因组比对时具有较大的优势。综上所述，本研究选择 作进一步的研究。而组蛋白 的位赖氨酸的三甲基化（）修饰被认为是植物多种生物过程中基因表达的激活因子 。的其他功能还包括在 前剪接、重组、修复和增强子活性方面的作用。在微藻中，组蛋白修饰的研究主要集中在
7、海洋硅藻和绿藻中，例如在工业产油微藻微拟球藻的研究 中 发 现 不 同 二 氧 化 碳 条 件 下，、和 的修饰不同程度，且这些修饰与碳代谢基因的表达水平密切相关。在莱茵衣藻中发现组蛋白乙酰化修饰与其热激效应有关。然而，以组蛋白修饰为基础的表观遗传学研究在链状亚历山大藻中仍然是缺乏的。为探究链状亚历山大藻在低氮条件下对环境胁迫的特异适应性反应机制。本研究利用染色质免疫共沉 淀测 序（，）方法探讨了链状亚历山大藻在氮限制条件下的生理反应和分子机制，比较了链状亚历山大藻在氮缺乏和氮正常条件下的 修饰的差异，分析了链状亚历山大藻在氮缺乏条件下相比正常培养条件调控的差异基因。本研究的目的是在表观遗传修
8、饰水平上揭示 对链状亚历山大藻缺氮环境的响应方式及具体的调控机制。材料和方法藻的培养，处理条件和计数链状亚历山大藻由中国海洋大学海洋生物遗传与育种教育部重点实验室保存。藻细胞在培养基中生长，光暗周期为 ，光照强度 ，温度 为（）。在 培 养 基 中 添 加 终 浓 度 为 氮（）生成正常培养基。而在低氮培养基中添加终浓度为 氮（）（见表）。每天在固定时间（：）采集样本，取样前，通过轻摇培养瓶使细胞均匀分布，然后从每个瓶中个位置吸取样品，每个位置重复吸取次。用于 细 胞 计 数 的 样 品（）在 鲁 戈 氏 溶 液（）中固定。然后在显微镜下的载玻片上进行计数，以制作藻的生长曲线，观察其生长状态，
9、确定采样时间。表链状亚历山大藻氮处理条件 .样品 处理条件 培养基（最终含氮量：）低氮培养基（最终含氮量：）注：氮正常；：低氮处理。：；：修饰水平的检测通过 检测正常和低氮处理条件下 的修饰水平。通过蔗糖密度梯度离心法提取核蛋白，蛋白定量试剂盒（供应商：，货号：）进行定量。以 作为内参抗体，用 兔源多克隆抗体（供应商：景杰生物，杭州）检测在不同处理条件下的 修饰水平。和 荧光定量 染色质免疫共沉淀（）在无菌条件下（无菌超净工作台及所用物品均经灭菌处理），将培养至第 天的正常和低氮处理条件下的链状亚历山大藻收集至 离心管中，用的甲醛在室温交联 ，随后用 的甘氨酸（终浓度为 ）室温淬灭交联反应 。
10、将收集的藻细胞用灭菌水清洗次去除甲醛并用液氮冷冻，冰箱保存。染色质提取方法按照 等 方法进行。随后使用非接触式超声仪（，）将染色质剪切成 的片段。解交联（酶 孵育半小时去除，加氯化钠，蛋白酶，过夜）并用凝胶电泳（琼脂糖凝胶）检测超声的效果。采用 试剂盒（）和 修饰抗体（）进行免疫共沉淀（）。根据试剂盒说明书进行解交联和 纯化步骤。采用 （供应商：，）定 量 浓 度。随 后 的 建 库 和 测 序 由 武 汉 生物科技有限公司完成。软件分析过程完成建库后，将高通量测序（测序平台）得到的原始图像数据文件经碱基识别（）转化为原始测序序期祁娟，等：氮限制条件下链状亚历山大藻 的调控机制解析列。随后使用
11、软件 （：）完成质控处理，并使用软件 （：）进行原始数据的过滤。然后将得到的数据使用软件（：）比对到一种共生甲藻（）基因组。接着通过比对得到基因组的有效序列的信息。最 后利 用 分 析 软 件（：）在基因组范围内分析 信息并以 作为阈值筛选显著性 。为了进一步探讨组蛋白修饰的结合位点特征，理解组蛋白修饰对基因调控的机制，对修饰调控的基因进行 和 富集分析。首先将 注释对应的基因数 目 进 行 统 计，然 后 按 照 分 子 功 能（）、细胞组分（）和生物学过程（）分类绘图。其次将 注释对应的基因进行富集分析，按照 筛选出显著性富集结果。同样，将 注释对应的基因数目进行统计，然后根据其功能进行分
12、类绘图。最后将 的 号对应的基因进行富集分析，并按照 筛选出显著性富集结果。荧光定量 为了验证 结果，本 文 作 者 从 结 果 中 随 机 选 取 个 差异调控基因进行 荧光定量实验即 验证。利用 软件设计引物（见表），采用 （生产商：翊圣生物技术有限公司）试剂，在 反应体系中进行 反应。反应体系包括：（），正向和反向 引 物（），（和 ，约 ）。每个样品进行个生物重复和个技术重复。表 引物 基因 正向引物 反向引物 结果正常和低氮条件下链状亚历山大藻的生长对低氮和正常条件下的链状亚历山大藻进行计数并绘制生长曲线（见图）。由图可见，在低氮处理条件下，在第天以后该藻细胞生长速率开始逐渐减慢且细
13、胞数逐渐减少，这表明在第天开始链状亚历山大藻开始逐渐产生氮胁迫。通过生长曲线确定选取第 天即氮胁迫最大时取样进行后续实验。低氮和正常条件下 的修饰水平采用 抗体对低氮和正常条件下提取的组蛋白进行杂交，结果如图所示，低氮（）和正常（）条件下的样品均在组蛋白（）处出现杂交条带，说明低氮和正常条件下均存在 的修饰；而相对正常培养条件，修饰水平虽然在低氮条件下相对较低，但也有一定程度的信号，说明 的修饰也发挥了一定的调控作用以响应环境氮限制。（：低氮 ；：氮正常 ）图链状亚历山大藻低氮和正常条件下生长曲线 .（：低氮 ；：氮正常 ）图链状亚历山大藻低氮和正常条件下 修饰水平 .中国海洋大学学报 年 结
14、果低氮与正常条件下 调控差异基因及其验证在 测序结果中，每一个样本的 质控在 以上，质控在 以上，在基因组映射中，本实验在低氮和正常条件下获得有效峰（）的数目分别为 和 个，且低氮条件下的比对率为 ；在 正 常 条 件 下 的 比 对 率 为 。为进一步研究组蛋白修饰的差异，本文作者还分析了低氮和正常条件下 调控的差异基因。通过对链状亚历山大藻不同处理条件下的调控基因进行比较分析，以 且 作为差异基因的筛选标准，分别获得在低氮条件和正常条件下差异基因 个，其中 个基因在低氮条件下被 特异调控（见图），说明 在低氮和正常条件下具有不同的调控方式，这可能与链状亚历山大藻对氮缺乏环境的特异性适应相关
15、。进一步采用 和 对 结果进行验证。在 中随机筛选个基因，包括细胞色素基因（）、合成酶基因（），核糖体 基 因（），泛 素 激 活 酶 基因（），核糖体 基因（）。以免疫前血清 免疫 样 品作 为 阴 性 对 照（）进 行 检测。结果表明 验证 实验中 和 中均富集到明显条带，且 中没有富集到（见图），中相对于阴性对照，各基因均表现出显著富集（见图），说明本研究获得的 结果经 验证是可信的。（：低 氮 ；：氮 正 常 ）；：和 中调控的共有基因 图 在低氮和正常条件下调控基因数目韦恩图 （：超声后样品 ；：免疫沉淀样品 ；：氮正常 ；：低氮 ；：每个免疫沉淀样品的 反应测出来的 值转变为表示总
16、 染色质的百分比的值 ）图 （）和 （）结果 （）（）低氮相对于正常条件上调基因的 富集分析为进一步分析 修饰在低氮条件下的特异调控方式，本文作者对低氮与氮正常条件下调控的基因进行了比较分析，在低氮条件下筛选出上调基因进行 富集分析，并将所有 富集结果按照值从小到大排序，取前 个 富集功能绘制气泡图，发现 在链状亚历山大藻低氮处理条件下，显著调控了无机阴离子、磷酸离子和无机溶质的摄取，次级活性物、无机磷酸盐和金属离子等相关的跨膜转运蛋白活性（见图）。在这些分子功能中，有一些基因同时兼具 有 许 多 其 他 功 能。其中 硝酸 盐 转 运 体（）、合酶亚单位（）、半 乳 糖 质 子 转 运 体（）、磷 酸 载 体 蛋 白（期祁娟，等：氮限制条件下链状亚历山大藻 的调控机制解析 ）、极性膜蛋白（）、高亲和力镍转运蛋白（）和铵转运蛋白（）等在这些生物学过程中被 所调控（见表）。图 在低氮相对于正常条件下调控差异基因的 富集分析 表低氮相对于正常条件上调基因的富集结果（部分）（）编号 条目 值 基因 ：，：，：，：，：，：，中国海洋大学学报 年续表编号 条目 值 基因 ：，：，：，低氮相对于正
