1、天 津 中 医 药 大 学 学 报Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine第 42 卷第 1 期2023 年 2 月Vol42No1Feb2023 实验研究 摘要：目的 探讨丹蛭降糖胶囊调控-链蛋白（-catenin 蛋白）在高磷诱导的糖尿病大鼠下肢血管内皮细胞钙化中的作用。方法 分离糖尿病大鼠和健康大鼠下肢股动脉内皮细胞进行体外培养，分为空白组、高磷组、丹蛭组、氯化锂（LiCL）组；调整稳转内皮细胞（EC 细胞）状态，除空白组外，其余各组加入高磷培养基（含有 10 mmol/L-甘油磷酸盐、50 mg/mL 维
2、生素 C 和 110-7mol/L 胰岛素）诱导细胞钙化，同时丹蛭组和 LiCL 组给予 10%含药血清（丹蛭降糖胶囊）干预，48 h 后 LiCL 组给予 20 mmol/L LiCl 继续干预 48 h。采用 DNA 断裂的原位末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡，噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测 平滑肌肌动蛋白（-SMA）、-catenin、碱性磷酸酶（ALP）、骨桥蛋白（OPN）、骨形态发生蛋白 2（BMP2）、卷曲同源物 1（FZD1）mRNA 表达水平；激光共聚焦显微镜观察细胞-catenin 蛋白定位。结果 与空白组比较，高磷组细胞凋亡数
3、、钙离子含量、-SMA、-catenin、ALP、OPN、BMP2 及 FZD1 表达量增多，细胞增殖数量减少（P0.01）；激光共聚焦显微镜观察结果表明-catenin 多表达于细胞核内。与高磷组比较，丹蛭组细胞凋亡数、钙离子含量、-SMA、-catenin、ALP、OPN、BMP2 及 FZD1 表达量减少，细胞增殖数量增多（P0.01），激光共聚焦显微镜下观察显示细胞核内-catenin 表达量减少。与丹蛭组比较，LiCL 组细胞凋亡数、钙离子含量、-SMA、-catenin、ALP、OPN、BMP2 及 FZD1 表达增加，细胞增殖数量减少（P0.01），激光共聚焦显微镜下观察显示细胞
4、核内-catenin 表达量增加。结论 丹蛭降糖胶囊可以减轻糖尿病大鼠下肢内皮细胞钙化，机制是通过下调-catenin 在细胞核内的表达，减少-catenin 蛋白合成，抑制下游细胞表型基因的转录，达到防治内皮细胞血管钙化的目的。关键词：糖尿病；丹蛭降糖胶囊；-catenin；内皮细胞钙化中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：16739043（2023）010081-06丹蛭降糖胶囊调控-catenin 蛋白在高磷诱导的糖尿病大鼠下肢血管内皮细胞钙化中的作用*倪英群1，方朝晖1，李居一1，施慧2，余丹丹2，刘光菊2，陈文娟2（1.安徽中医药大学第一附属医院，合肥230031；2.安徽
5、中医药大学，合肥230038）*基金项目：国家自然科学基金资助项目（82274468）；安徽省自然科学基金资助项目（1908085MH267）；国家中医药管理局国家中医临床研究基地业务建设科研专项课题项目（JDZX2015123）；安徽省高校优秀人才支持计划项目（gxyqZD2021114）；安徽中医药大学临床科研项目（2021yfylc07）；新安医学教育部重点实验室开放项目（2022XAYX06）。作者简介：倪英群（1981-），女，博士，副主任医师，主要从事中医药防治代谢内分泌疾病方向研究。引用格式：倪英群，方朝晖，李居一，等.丹蛭降糖胶囊调控-catenin 蛋白在高磷诱导的糖尿病大鼠
6、下肢血管内皮细胞钙化中的作用J.天津中医药大学学报，2023，42(1)：81-86.DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2023.01.16血管钙化（VC）是糖尿病病情恶化、病死率增加的高危因素。在对 21 万例患者随访 10 年的 Meta 分析中显示，VC 患者的总死亡风险和心血管事件风险是无血管钙化患者的 34 倍1。无论 1 型还是 2型糖尿病患者，VC 的发生率均高于非糖尿病患者2-3。糖尿病 VC 可分为内膜钙化和中膜钙化，内膜钙化与内膜增生和动脉粥样硬化性病变密切相关，累及大血管，相较于中膜钙化更易致血栓形成、斑块破裂，发生心血管事件。受多种因素的影响，
7、内皮细胞可通过内皮-间充质转化（EndMT）激活骨形态发生信号，也可通过释放细胞因子及基质囊泡等促进血管平滑肌细胞发生成骨样分化，导致 VC。因此，围绕内皮细胞（EC）的相关研究是 VC 防治领域的一个热点。目前，EC 钙化的确切机制仍不清楚，临床治疗上还缺乏有效的措施。中医药具有延缓或阻止81天 津 中 医 药 大 学 学 报Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine第 42 卷第 1 期2023 年 2 月Vol42No1Feb2023并发症、提高患者生活质量、多靶点整体论治、减少西药依赖、调节失调的脏腑功能等
8、多重优势，为此一些学者开始了中药单体、复方等方面的研究，并取得了一定进展。中医学理论将糖尿病血管钙化归属于“瘀血”“胸痹”“脉痹”范畴，病位在脉4，基本病机为“瘀血内阻”，治疗原则当以益气活血为主。本课题组前期研究已经证实具有益气活血功效的丹蛭降糖胶囊能够下调 Wnt/-链蛋白（-catenin）通路的信号分子-catenin 水平，改善颈动脉内膜中层（IMT）厚度、缩小斑块面积、保护血管5。以此为基础，本项目研究丹蛭降糖胶囊通过Wnt/-catenin 调控下肢血管内皮细胞钙化的作用，以期拓宽糖尿病血管病变的防治途径。1材料与方法1.1动物健康 SD 大鼠，购自安徽省实验动物中心，动物许可证
9、号：SCXK（皖）2017-001。1820 周龄，体质量均在（18020）g。安徽中医药大学实验中心动物房饲养，保持室温、相对湿度 45%75%，自然光照周期，适应性喂养 1 周。1.2实验药物丹蛭降糖胶囊（太子参、牡丹皮、生地黄、泽泻、菟丝子、水蛭）：0.38 g/粒，安徽中医药大学第一附属医院制剂中心生产，皖药制字：Z20090006，批号：20190316，国家专利号：ZL200310112845.1。1.3试剂主要试剂：VWF 抗体（11778-1-AP，proteintech，中国）；In Situ Cell Death Detection Kit（11684795910，罗氏，瑞
10、士）；抗荧光淬灭剂（S2100，Solarbio，中国）；4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，D106471-5 mg，阿拉丁，中国）；Super M-MLV 反转录酶（PR6502，BioTeke，中国）；2Power Taq 聚合酶链反应（PCR）MasterMix（PR1702，BioTeke，中国）；DMEM 培养基（12100-038，普诺赛，中国）。1.4仪器主要仪器：激光扫描共聚焦显微镜（OLYMPUS）；超速冷冻离心机（H-2050R，湖南湘仪）；荧光定量 PCR 仪（Exicycler，BIONEER）；二氧化碳（CO2）培养箱（HF-90，上海力申）。2方法2.1模型建
11、立、细胞提取、分组SD 大鼠 10 只适应性饲养 1 周后，予高脂饲料喂养（普通饲料68.5%、猪油 10%、蔗糖 20%、猪胆盐 0.5%、胆固醇1%），第 13 周模型组单次腹腔注射链脲佐菌素（STZ，35 mg/kg）并继续高脂饮食，第 14 周检测大鼠空腹血糖，按照 2 型糖尿病的诊断标准，空腹血糖11.1 mmol/L 为造模成功6。造模成功后取大鼠右下肢股动脉，提取大鼠 EC，根据 EC 的培养方式（用含10%胎牛血清的 DMEM 培养基于 37，5%CO2）进行培养。分组为：高磷组、丹蛭组、氯化锂（LiCL）组。另取 10 只健康大鼠，取同一位置单个 EC 作为空白组。调整各组稳
12、转 EC 状态，除空白组外，其余各组加入高磷培养基（含有 10 mmol/L-甘油磷酸盐、50 mg/mL 维生素 C 和 110-7mol/L 胰岛素）诱导细胞钙化，同时丹蛭组和 LiCL 组给予 10%含药血清（丹蛭降糖胶囊）干预。48 h 后，LiCL 组给予 20 mmol/LLiCl 继续干预处理 48 h。2.2含药血清的制备及干预方法取 10 只健康SD 大鼠，体质量（18020）g，随机分为 2 组，即空白组和实验组。实验组以灌胃的方式给予丹蛭降糖胶囊 5.4 g 生药/（kg d，相当于 60 kg 成人等效剂量10 倍）；同时空白组灌胃给予 3 mL 生理盐水。两组均连续给
13、药 7 d。末次给药后，常规麻醉大鼠，无菌条件下取腹主动脉血，于 3 000 r/min 离心后取血清（离心半径为 10 cm），56 水浴灭活 30 min，同组混匀，0.22 m 滤膜过滤除菌，在-80 条件下真空干燥 48 h，干燥粉末-20 保存备用。2.3检测指标及方法2.3.1细胞凋亡和增殖的检测实验采用原位末端标记（TUNEL）法和噻唑蓝（MTT）法检测：1）大鼠股动脉 EC 培养在 M199 培养基中，进行细胞传代，当细胞长至 80%90%时，去除培养基，加磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗 12 次，进行胰酶消化 13 min 后，终止消化，将消化的细胞转移至 15 mL 离心管中，
14、1000r/min 离心 5 min（离心半径为 10 cm）。倒掉上清后，13 传代至培养皿中培养。将细胞分别种在 6 孔板中，每孔种 1106 个细胞。2）待细胞贴壁后，使用不同含药血清的培养基培养细胞。3）24 h 后，收集培养上清，胰酶消化，1 000 r/min 离心 5 min（离心半径为 10 cm），弃上清。PBS 洗 3 次，4，1 000 r/min离心 5 min（离心半径为 10 cm），弃上清。4）加入100Lbindingbuffer 重悬细胞，加入 5 L PI 和 5 LFITC-Annexin V，混合均匀，常温避光孵育 15 min，加入 400 L bin
15、ding buffer 混匀，立刻用流式细胞仪检测。MTT 法测细胞增殖接上述步骤 3）：培养 24 h后，向培养基中加入 10 L MTT（5 mg/mL），在细胞培养箱中继续培养约 3 h。去除培养基，每孔加入100 L 二甲基亚砜（DMSO），摇晃均匀，570 nm 波长测定吸光度。2.3.2实时定量（RT）-PCR mRNA 检测Trizol 法82天 津 中 医 药 大 学 学 报Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine第 42 卷第 1 期2023 年 2 月Vol42No1Feb2023表 1丹蛭降
16、糖胶囊对 EC 钙离子含量及细胞增殖、凋亡数量的影响（xs）组别动物数钙离子含量（mmol/L）细胞增殖数量（光密度）细胞凋亡数量（%）空白组30.1060.0200.730.012.710.06高磷组30.4300.019*0.470.02*10.030.77*丹蛭组30.2580.019#0.710.01#4.630.32#LiCL 组30.4040.0340.440.018.560.65注：与空白组比较，*P0.01；与高磷组比较，#P0.01；与丹蛭组比较，P0.01。表 2丹蛭降糖胶囊对-catenin、-SMA、ALP、FZD1 mRNA 表达的影响（xs）组别动物数-SMA-cateninALPOPNBMP2FZD1空白组31.000.031.000.071.000.091.000.081.000.061.000.09高磷组33.680.23*4.510.16*4.020.13*5.320.50*4.710.24*4.680.40*丹蛭组31.910.13#2.180.05#2.330.18#3.080.10#2.510.19#2.150.04#LiCL 组33.450.
