1、Vol.51，No.4 2023(total 389)基于缺失重组实验的藏灵菇优势菌种对发酵乳品质的影响严胜蓝1,2，周钺1,2，王洪伟1,2，张玉1,2，宋佳佳1,2，刘士健1,2，索化夷1,2（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.川渝共建特色食品重庆市重点实验室，成都 610039）摘要：为筛选藏灵菇发酵剂并探究其优势菌种对发酵乳品质的贡献，分别比较了 8 份自然藏灵菇和冻干藏灵菇发酵乳的品质差异，依据菌株活性和品质相似性筛选出一份适用于制备冻干发酵剂的藏灵菇，并分析其优势菌种，通过菌种缺失重组试验，探究各优势菌种对发酵乳品质的影响。结果表明冻干藏灵菇发酵剂的优势菌种包括 K
2、azachstania unispora（单孢哈萨克斯坦酵母）、Lactobacillus kefiri（开菲尔乳杆菌）、Lactococcus lactis subsp.lactis strain（乳酸乳球菌乳酸亚种）、Leuconostoc mesenteroides（肠膜明串珠菌）、Acetobacter cibinongensis（芝庇侬醋杆菌）和 Acetobacter fabarum（可可豆醋杆菌），这些优势菌种对细菌总数、酸度、持水力和关键香气成分等指标会产生显著差异。本研究探究了藏灵菇优势菌种对发酵乳品质的影响，为开发冻干藏灵菇发酵剂和藏灵菇发酵乳工业化生产提供了参考。关键词：
3、藏灵菇；冻干发酵剂；发酵乳；品质风味中图分类号：TS252.54文献标识码：A文章编号：1001-2230(2023)04-0011-06doi:10.19827/j.issn1001-2230.2023.04.002Effect of dominant strains of Tibetan kefir on fermented milk quality based ondeficiency recombination experimentsYAN Shenglan1,2,ZHOU Yue1,2,WANG Hongwei1,2,ZHANG Yu1,2,SONG Jiajia1,2,LIU Sh
4、ijian1,2,SUO Huayi1,2(1.College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China;2.Chongqing Key Laboratory of SpecialityFood Co-Built by Sichuan and Chongqing,Chengdu 610039,China)Abstract：In order to screen the Tibetan kefir ferment and investigate the contribution of its dominant strai
5、n to the quality of fermented milk,wecompared the quality differences between eight natural Tibetan kefir and freeze-drying Tibetan kefir fermented milk,and selected a suitable Tibetan kefir for the preparation of freeze-drying fermenters based on strain activity and quality similarity,and analyzed
6、its dominant strain.Then theeffect of each dominant strain on the quality of fermented milk was investigated through strain compounding and deletion-deletion recombinationtests.The results showed that the dominant strains of freeze-dring Tibetan kefir fermenters included Kazachstania unispora,Lactob
7、acillus kefiri,Lactococcus lactis subsp.lactis strain,Leuconostoc mesenteroides,Acetobacter cibinongensis and Acetobacter fabarum.These dominant strains can produce significantdifferences in indicators such as total bacterial count,acidity,water retention and key aroma components.This study investig
8、ated the effect of thedominant strain of Tibetan kefir on the quality of fermented milk,and provided a reference for the development of freeze-drying Tibetan kefirferment and the industrial production of Tibetan kefir fermented milk.Key words：Tibetan kefir;freeze-drying starter;fermented milk;qualit
9、y and flavour0引言藏灵菇（Tibetan kefir，TK），又名西藏开菲尔，是中国西藏地区的传统发酵乳1。藏灵菇与开菲尔同属一个品系，外观呈乳白色至淡黄色片层状，表面湿润且有褶皱。藏灵菇包含具有共生关系的酵母与细菌2。酵母与细菌共同产生的胞外多糖及糖蛋白等物质形成了具有胶黏性和弹性的片层状物质，其中胞外多糖被证实能够抑制有害菌生长，抗肿瘤活性和调节肠道免疫系统等功效，可以提高这种多菌种共生体的抗逆性，减少有害菌的黏附3。研究表明开菲尔具有抗炎，抗氧化，抗癌等作用4。开菲尔发酵乳制品可以提高发酵乳的感官特性和营养价值，具有广阔的研究前景5。然而在我国对藏灵菇和开菲尔的工业化生产研
10、究尚处于起步阶段，藏灵菇收稿日期：2022-11-26基金项目：西藏自治区科技重大专项（XZ202201ZD0001N）；重庆市高校创新研究群体项目（CXQT21007）。作者简介：严胜蓝（1998-），女，硕士研究生，研究方向为功能益生菌。通讯作者：索化夷112023年第51卷第4期（总第389期）发酵的乳制品至今尚未工业化生产6。藏灵菇必须依赖原粒增殖，即在适宜条件下将藏灵菇置于动物乳中发酵约 24 h7。藏灵菇可以在发酵乳中分裂增殖形成新粒，滤出增加的藏灵菇粒才可以继续用于发酵新一批的发酵乳，这是藏灵菇的传统传代培养方式8。开菲尔中含有许多乳酸菌，醋酸菌和酵母菌，不同来源的藏灵菇微生物存
11、在差异，传代过程中微生物多样性和稳定性也会发生变化9-10。藏灵菇发酵乳质量很大程度上取决于发酵剂中的微生物组成，但其中微生物物种对发酵乳品质的影响和贡献尚未阐明11。藏灵菇发酵剂独特的制备方式导致了藏灵菇发酵乳工业化生产的局限性，如每一批藏灵菇品质存在差异、菌群结构失衡、发酵品质不稳定、重复性差等问题。探究藏灵菇中微生物主要菌种对藏灵菇发酵乳品质的影响是藏灵菇发酵剂工业化开发的前置条件。本研究通过典型藏灵菇发酵乳筛选优势微生物模拟天然藏灵菇发酵酸乳发酵，并明确其中的优势菌种和对发酵乳品质的影响，以期为藏灵菇复配发酵剂的开发提供参考，为解决藏灵菇发酵乳工业化难题打下基础。1 材料与方法1.1
12、材料1.1.1 样品在西藏林芝地区 8 户牧民家中分别采集 8 份藏灵菇样品，编号为 TK1-TK8。1.1.2 试剂MRS 肉汤培养基，英国 OXOID 公司；琼脂、PDB 液体培养基，北京索莱宝生物科技有限公司；分析纯乙醇，分析纯冰乙酸，重庆市钛新化工有限公司；分析纯 2,3-丁二酮，天根生化科技（北京）有限公司；分析纯异戊醇，北京迈瑞达科技有限公司；酵母基因组 DNA 提取试剂盒。1.1.3 仪器与设备SW-CJ-SF 超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；SPX-250BE 生化培养箱，上海力辰邦西仪器科技有限公司；5810 型高速低温离心机，德国 Eppendorf公司；LGJ-10
13、 型冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；DB-WAX（30 m0.25 mm0.05 m）毛细管色谱柱，美国安捷伦公司；GC-2010 气相色谱仪，日本岛津公司。1.2 方法1.2.1 实验步骤1.2.1.1 制备自然藏灵菇发酵乳将 8 份藏灵菇样品分别接种至灭菌全脂乳中，28 培养 24 h 后滤出增殖的新鲜藏灵菇，再将其接种至新的灭菌全脂乳，活化 47 代12。以接种量 60 g/L将藏灵菇粒接种至灭菌全脂乳中，用无菌透气塑膜封口置于 28 下培养 24 h 形成凝乳。1.2.1.2 制备冻干藏灵菇发酵乳将灭菌的 0.6%酵母膏、3.0%甘油和 12.5%蔗糖与 10 mL 藏灵菇发
14、酵乳混合均匀，待完全溶解后置于-80 预冻后冷冻干燥，制备成藏灵菇冻干发酵剂，发酵乳接种量为 60 g/L。1.2.1.3 筛选适用于制备冻干发酵剂的藏灵菇比较藏灵菇发酵乳和冻干藏灵菇发酵乳品质、关键香气成分及感官评价的差异，筛选出一份具有制备冻干藏灵菇发酵剂潜力的、冻干藏灵菇发酵剂发酵乳品质与原藏灵菇发酵乳品质最为相近的典型藏灵菇样品。1.2.1.4 典型藏灵菇样品菌种分离纯化、鉴定及优势菌株筛选参照何玉婷13的方法分离纯化典型藏灵菇样品中的食品可用菌，使用商业试剂盒提取细菌和酵母菌株的 DNA，利用细菌通用引物 27F 和 1492R 以及酵母通用引物 ITS1 和 ITS4 对其进行扩增
15、。将分离的菌株活化培养 23 代后，在无菌条件下按 5%接种量将乳酸菌接种至全脂乳中无氧发酵 24 h，醋酸菌接种至 MRS、酵母菌接种至 PDB 液体培养基中有氧发酵 24 h，以筛选具有良好发酵性能的菌株再进行复配。选出发酵酸乳凝乳完整并且滴定酸度70 T 的乳酸菌，酸化能力较高的醋酸菌和具有明显发酵香气的酵母菌，用筛选的优势菌种进行复配实验。1.2.1.5 优势菌种缺失重组发酵酸乳按典型藏灵菇样品原有菌种比例并缺失一类菌株，将优势菌种组合制成复配发酵剂，用缺失或全菌种组合成复配发酵剂发酵酸乳，比较冻干复配发酵剂发酵酸乳与原藏灵菇发酵乳品质和关键香气成分的差异，探究藏灵菇冻干发酵剂中各优势
16、菌种对藏灵菇发酵乳的影响。1.2.2 指标测定1.2.2.1 发酵乳微生物、滴定酸度及持水力测定参照 GB 4789.35-2016乳酸菌检验、GB 4789.15-2016 霉菌和酵母计数、GB 5009.239-2016 食品酸度的测定 分别测定发酵乳菌落总数和滴定酸度。将发酵 24 h 后的凝乳在 4 条件下 12 000 r/min 离心10 min，弃去上清得到酸乳悬浮物质并称重，每份样品重复 3 次实验，持水力计算按如下公式：持水力/%=悬浮物质质量(g)/发酵乳质量(g)1001.2.2.2 发酵乳关键香气成分定量分析标准曲线的制作：准确称取乙醇、双乙酰、异戊醇和乙酸的标准品，用超纯水逐级稀释，以各级别标准品溶液的梯度浓度为横坐标，平行测定峰面积的平均值为纵坐标，建立各成分的定量线性关系。气相条件：进样温度 250，分流比 6.0；尾吹气：高纯氮气流速 19 mL/min，氢气流速 30 mL/min，空气流速 300 mL/min；乙醇、双乙酰、异戊醇的升温程序：起始柱温 40 保留 2 min，以 3.9/min 升至 90 保持 0.5 min；乙酸的升温程序：起始
