1、书书书贵州农业科学 ，（）：收稿日期：基金项目：贵州省科技计划项目“黔产金钗石斛 基因的克隆与功能鉴定”黔科合基础（）；国家自然科学基金项目“型 在铁皮石斛种子发育过程中的功能研究”（）作者简介：杨涛（），男，在读硕士，研究方向：药用植物分子生物学。：通讯作者：邹颉（），男，副教授，博士，从事植物生殖生物学研究。：基于全基因组鉴定与分析金钗石斛 基因家族杨涛，马庆，邹西西，陈念，邹颉（贵州中医药大学，贵州 贵阳 ）摘要：【目的】探明金钗石斛（）基因家族的结构与功能，为研究 家族在金钗石斛生长发育过程中的功能提供参考。【方法】采用全基因组鉴定及分析技术对金钗石斛 家族成员进行鉴定，并进行生物信息
2、学和基因表达模式分析。【结果】金钗石斛基因组中有 个 基因（），大部分 基因不含有内含子，仅 、个 基因有内含子，分布在 、个亚族当中；金钗石斛 基因不均匀的分布在染色体上，普遍存在于基因密度较高的区域，并未出现染色体内的串联重复现象，其中，仅有 对 基因具有共线性，具有高度同源性；基因含有赤霉素响应、低温响应、生长素响应、防御与应激响应等与生长发育相关的顺式作用元件。和 基因在根中表达最高，在茎、叶、花中也有不同程度表达。【结论】家族基因在根部表达量较高。推测 家族基因可能在根中起重要的调控作用，从而影响金钗石斛根的生长发育。关键词：金钗石斛；生物信息学；转录组数据分析；调控中图分类号：文献
3、标识码：文章编号：（），（，）：【】.【】.，【】（）.，；.，【】，.：；引言【研究意义】金钗石斛（）作为兰科多年生草本植物，属传统名贵中药，为中国珍稀濒危的中药种类之一，其茎在多个亚洲国家已有数百年的用药历史。由于金钗石斛生长缓慢，价格昂贵，现今已不能满足人们的用药需求。基因家族是植物中重要的转录因子基因家族之一，在许多生物生长发育过程中起不同作用。采 用 生 物 信 息 学 方 法 对 金 钗 石 斛 基因家族进行系统鉴定和分析，了解该基因家族在金钗石斛生长发育过程中的功能，对推动金钗石斛的科学栽培及其产业化 发 展 意 义 重 大。【前 人 研 究 进 展】蛋白具有多功能作用，调节植物
4、生长和发育的各个方面，其名称来源于首批分离出的个成员、和 。通常，蛋白含有 个氨基酸，由端 的个 不 同 基 序 组 成，依 次 顺 序 为、和 基序，其中，两侧是 和 ，基 序 是 蛋 白 的 核 心 成分，含有非常保守的单位，并以结束，对保守的蛋白质序列特征、和 可 以 被 识 别 并 组 装 成 基序，这可能与磷酸化相关；基序有个保守的氨基酸对，分别是、和。这个保守的基序顺序在大多数已识别的 成员中相似，其高度保守性表明对 蛋白功能至关重要，这些保守的基序可以直接影响 蛋白的功能。和 对于 蛋白的同源二聚化至关重要，末端区域是 蛋白执行特定功能的关键部分，能与各种靶点的蛋白相互作用，表现
5、出 家族成员之间互作蛋白的特异性，从而在植物多 种 信 号 通 路 中 起 到 重 要 作 用。目 前，基因家族已经被鉴定出 个亚家族，分 别 是 、和 。由于全基因组测序技术的飞速发展，不同植物中的 基因家族被广泛的研究，至今已有数十种植物物种的 基因家族被鉴定及功能分析，发现其在根和芽发育过程中，赤霉素（）信号传导和植物色素信号转导起着重要 作 用。许 多 基因含有核定位信号，已证实多种 家族蛋白质是核定位的。有研究发现，基因还参与植物的抗逆性，响应环境压力。基因还能通过调节多种生理过程如信号传递、代谢产物合成、植物激素等，以促进植物的生长和发育。【研究切入点】目前，金钗石斛中的 基因成员
6、尚未得到全面调查和系统分析，其基因家族的结构与功能不明确。【拟解决的关键问题】采用生物信息学分析方法，利用金钗石 斛 全 基 因 组 序 列 信 息 鉴 定 金 钗 石 斛 基因家族，并分析其家族成员的基因结构、编码蛋白特征、进化特点，同时利用金钗石斛转录组数据分析家族基因成员的组织表达模式，为 家族基因在金钗石斛生长发育中的功能研究提供参考依据。材料与方法 材料下载 数据库金钗石斛基因组数据信息进行研究。方法 金钗石斛 基因的鉴定从 数据库下载金钗石斛的基因组数据，从 数据库获得水稻和拟南芥的 基因家族的数据，采用 利用拟南芥 基因和水稻 基因的蛋白序列，与金钗石斛的蛋白序列进行本地 搜 索
7、，删 除 重 复 的 基 因，利 用 提取候选 基因的蛋白序列，同时采用 的在线工具（：）进行蛋白序列结构域搜索，利用 进行可视化，进而筛选具有 结构域的蛋白序列，从而获得所有金钗石斛具有 结构域的基因 和蛋白序列。蛋白质的基本理化特性采用 在线网站（：）对 基因家族的蛋白质分子质量、氨基酸数目、等电点、不稳定系数、脂肪系数、总平均亲水性种蛋白的物理特性进行预测分析。贵 州 农 业 科 学 金钗石斛 基因系统进化树构建利用拟南芥、水稻、金钗石斛个物种的 蛋白序列进行系统发育分析，采用 最近邻接法（，）构建系统发育进化树，利用 进行进化树美化，便于对不同物种的 基因家族蛋白进行比较分析。金钗石斛
8、 基因的基因结构、保守基序、结构域及多重序列比对分析利用金钗石斛基因组数据信息，使用 分析金钗石斛的 基因家族的内含子外显子结构；利用 获得的基因结构域数据采用 进行 基因结构域可视 化 分 析；采 用在 线 网 站（：）获得 分析数据，采用 进行可视化进行基因的保守 预测分析。利用 进行多重序列比对参数默认，用 格 式 文 件 保 存 金 钗 石 斛 基因多重序列比对数据，采用 工具进行手动调整，便于对金钗石斛 基因蛋白序列进行比对分析。金钗石斛 基因染色体定位分析通过金钗石斛基因组数据信息与金钗 石 斛 基 因 的 位 置 信 息，使 用 进行金钗石斛的 基因染色体定位，对金钗石斛 基因在
9、染色体上分布情况进行分析。金钗石斛 基因启动子顺式作用元件分析利用 提取金钗石斛 基因起始密码子上游 的序列，采用 数据库（：）搜 索 启 动 子 的 顺 式 作 用 表 达元件。金钗石斛 基因组内和种间共线性分析为了解 基因在金钗石斛的基因组内和种间的共线性情况，利用金钗石斛、拟南芥、水稻基因组数据信息，采用 进行基因组内和种间共线性分析，绘制出相关的共线性关系图谱。金钗石斛 基因在各组织部位的表达情况分析为分析 基因在金钗石斛不同组织中的表达情况，从 数据库下载未经处理的根、花、叶、茎个组织部位的转录组数据。利用 进行 数据分析，构建 基因在各组织部位的表达模式图。基因表达量值采用（）表示
10、，生成基因表达量热图。结果与分析 金钗石斛 基因的鉴定和理化性质金钗石斛 基因家族共鉴定出金钗石斛 基因 个（），通过分析金钗石斛 蛋白的理化性质，个 蛋白的序列为 个 氨 基 酸，分 子 质 量 为 ，等电点为 ，不稳定系数为 ，脂 肪 系 数 为 ，总 平 均 亲 水 性 为 （表）。金钗石斛 基因系统进化树构建由图可见，基因可分为 个亚族，分 别 是 、和 亚族，而金钗石斛 基因分布在这 个亚族中，其中，亚族成员个，亚族成员个，亚族成员个，亚族成员个，亚族成员个，亚族成员个，亚族成员 个，亚族成员个，亚族成员个和 亚族成员个；同一个亚族基本上聚在一起，表明这些亚族的基因成员间具有一定的同
11、源性。期杨涛 等基于全基因组鉴定与分析金钗石斛 基因家族表金钗石斛 基因家族成员基因组信息及蛋白理化特征 .基因登录号 基因名 氨基酸个 分子质量 等电点 不稳定系数 脂肪系数 总平均亲水性 贵 州 农 业 科 学图 基因系统发育树 金钗石斛 基因的基因结构、保守基序、结构域及多重序列比对为了进一步了解金钗石斛 基因的基因结构，通过分析内含子外显子结构发现，金钗石斛 个 基因中仅个有内含子 结 构，分 别 是 、和 ，其余 基因均无内含子结构；在具有内含子的基因中 和 具 有 更 长 的 内 含 子（图）。在网站上分析保守蛋白质基序，并将其设置为 ，金钗石斛 基因的保守基序大多存在于端结构域，
12、并按 、的顺序排列，其中，保守度最高。同一亚族中基因的保守基序相同。其中，的缺失发生在、和 亚族的成员中。、和 具有非常稳定的保守端结构域，并且这些亚族中不存在基序缺失（图）。结构域分析显示，个 基因均具有 结构域，其中，和 这个基因缺失结构域较严重（图）。多重序列比对发现，金钗石斛 蛋白氨基酸序列均含有典型的 结构域、结构域、结构域、结构域、结构域（图），表明这些结构域非常保守。期杨涛 等基于全基因组鉴定与分析金钗石斛 基因家族图金钗石斛 基因的基因结构 .图金钗石斛 基因保守 预测及蛋白结构域 .贵 州 农 业 科 学图金钗石斛 基因家族氨基酸序列多重比对 .金钗石斛 基因染色体定位从图可
13、知，基因家族成员不均匀的分布在 条染色体上。其中，染色体 分布有个 基因；分布有个 基 因，分 布 有个 基因，分布有个 基因，分布有个 基因，分布有个 基因，其余 基因在染色体上零散分布。通过染色体的基因密度发现，基因普遍存在于基因密度比较密集的地方，且有部分基因成员成对分布于染色体近 末 端 等 重 组 频率较高的 区域，说明 基因家族成员中可能存在由于基因串联复制产生的结构相似、功能类似的基因簇。注：红色字体是金钗石斛 基因的名称，染色体内部颜色的深浅表示基因密度。：.，图金钗石斛 基因染色体定位 .期杨涛 等基于全基因组鉴定与分析金钗石斛 基因家族 金钗石斛 基因启动子顺式作用元件由图
14、可见，个金钗石斛 基因家族成员起始密码子上游 启动子区域含有多种顺式作用调节元件，其中，光响应（）和 响应（）种元件大量存在，是一种常规的顺式作用调节元件。脱落酸响应（）、厌 氧 诱 导（）、低温响应（）、伤 口 响 应（）和防御与应激响应（）等应激相关顺式作用调节元件在 基因家族成员启动子区分布也较普遍，说明 基因家族在金钗石斛抗逆响应中扮演重要角色。部分 家族成员启动子区域含有赤霉素响应（）、生长素响应（）元件，说明这部分基因可能在激素调控植株生长发育过程中起重要作用。通过基因家族启动子元件分析，推测 基因家族可能参与金钗石斛各个生命过程的调控。图金钗石斛 基因家族成员启动子元件 .贵 州
15、 农 业 科 学 金钗石斛 基因组内和种间共线性通过对金钗石斛 基因绘制共线性图谱（图）显示，金钗石斛 个 基因存在 对共线性关系，无串联重复基因，其中，亚族有对同源基因，和 亚 族 各对 同 源 基 因，和亚族各对同源基因。号和 号染色体中存在对同源基因，号染色体中存在对同源基因，号、号、号、号和 号染色体各有对同源基因。对拟南芥、金钗石斛和水稻构建物种间 基因共线性图谱（图），金钗石斛与拟南芥存在 对共线性关系，与水稻存在 对共线性关系。表明，基因存在早于单子叶植物与双子叶植物的分化时间。注：红色线条表示金钗石斛 基因组内共线性关系，第圈表示染色体，第圈表示未知碱基分布情况，第圈表示 含量
16、分布情况，第圈表示基因的密度，黑色字体表示金钗石斛 基因的名称。：.；，.图金钗石斛 基因组内共线性关系 .图拟南芥、金钗石斛和水稻共线性关系 ，.期杨涛 等基于全基因组鉴定与分析金钗石斛 基因家族 金钗石斛 基因在不同组织中的表达由图可见，金钗石斛 基因家族成员中绝大部分成员在根、茎、叶、花个组织中表达量较低，少部分基因在各组织中有较高表达，其中，和 基因在根中表达最高，在茎、叶、花中也有不同程度表达，推测这个基因对金钗石斛的生长和发育起到重要的调控作用，特别在金钗石斛根部的生长调控中发挥着关键作用。图金钗石斛 基因表达模式 .讨论 基因家族是植物中特有的基因家族，在转录调控和控制植物生长发育的各种信号转导途径中起着至关重要的作用。目前，基因家族中存在 个不同的亚族，不同的亚族参与不同的生物学功能。有研究表明，亚家族参与了、光和 的信号传导及转录调控过程，调节植物的生长发育；和 亚家族参与调控植物根的径向生长和生长发育 ；在根系发育过程中 亚家族参与了 信号传导途径与 途径的整合；亚家族通过转录调控参与生长素响应和应激响应等过程；亚族参与了植物色素光信号转导与植物防御相关信号通路；亚
