1、酿酒科技2023年第4期（总第346期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.4(Tol.346)DOI：10.13746/j.njkj.2022218作者简介：李朝云（1993-），男，工学硕士，初级工程师，研究方向：酿酒微生物，发酵工程。基于高通量测序对不同陈放时间大曲细菌群落特征研究李朝云1，唐平华1，罗平2，付宇豪2，曾祥卫2，佘露露1*(1.仁怀酱香白酒科研所，贵州 遵义 564500；2.贵州茅台镇北街酒厂(集团)有限责任公司，贵州 遵义 564500)摘要：高通量测序技术是现阶段微生物测序的主要手段，采用16S rDNA探究陈放1个月、4
2、个月、6个月的黄、黑、白大曲中微生物群落特征，结果表明：在9例大曲中，共鉴定出10个菌门和109个菌属，发现大曲中Firmicutes为第一优势菌门，Actinobacteria、Proteobacteria是大曲中的优势菌门；Kroppenstedtia，Saccharopolyspora为大曲中重要菌属；在1个月、4个月、6个月大曲中分别检出155个、103个、225个属，共有的有71个属，分别单独含有的有41个、6个、99个属，Novosphingobium是存放1个月大曲中显著富集的差异物种，Staphylococcus和Thermoactionmyces是存放4个月大曲中显著富集的差
3、异物种，Lactococ-cus是存放6个月大曲中显著富集的差异物种；主成分分析（PCA）和主坐标分析（PCoA）分析发现1个月、4个月、6个月大曲微生物构成差异较大；非加权组平均法（UPGMA）聚类树分析和大曲属水平上的物种丰度聚类图分析结果再一次印证不同存放时间大曲样本均无明显相似性。探究不同陈放时间大曲的微生物结构特征为酱香型白酒风味物质的产生提供了理论依据，为大曲中特征微生物的分离筛选培养提供了数据支撑。关键词：酱香大曲；高通量测序；群落结构中图分类号：TS262.3；TS261.1文献标识码：A文章编号：1001-9286（2023）04-0032-08Study on Bacter
4、ial Community Characteristics of Daqu Stored forDifferent Periods by High-Throughput SequencingLI Zhaoyun1,TANG Pinghua1,LUO Ping2,FU Yuhao2,ZENG Xiangwei2and SHE Lulu1*(1.Renhuai Jiangxiang Baijiu Research Institute,Zunyi,Guizhou 564500;2.Maotai Town BeijieDistillery(Group)Co.Ltd.,Zunyi,Guizhou 564
5、500,China)Abstract:High-throughput sequencing was used to study the microbial community characteristics of yellow,black and white Daqustored for one,four and six months.The results showed that 10 phyla and 109 genera were identified in nine Daqu samples.Fir-micutes was the first dominant phylum in D
6、aqu,followed by Actinobacteria and Proteobacteria.Kroppenstedtia and Saccharopolyspo-ra were important genera in Daqu.In Daqu stored for one,four and six months,155,103 and 225 genera were detected,respectively,among which 71 genera were common genera.Novosphingobium was a significantly enriched spe
7、cies in Daqu stored for one month,Staphylococcus and Thermoactionmyces were significantly enriched in Daqu stored for four months,and Lactococcus were signifi-cantly enriched in Daqu stored for six months.Principal component analysis(PCA)and principal co-ordinates analysis(PCoA)showed that the micro
8、bial composition of Daqu stored for one,four and six months was quite different.The results of cluster tree anal-ysis with weighted pair-group method with arithmetical means(UPGMA)and cluster diagram analysis of species abundance at genuslevel once again confirmed that there was no obvious similarit
9、y among Daqu samples stored for different periods.This study has pro-vided theoretical basis for the formation of flavor substances in Jiangxiang Baijiu,and data support for the isolation,screening andcultivation of characteristic microorganisms in Daqu.Key words:Jiangxiang Daqu;high-throughput sequ
10、encing;community structure3232酱香白酒是中国特有的一种高度蒸馏酒，生产过程中采用高温制曲工艺，使其富集了大量的微生物和酶系1。在发酵前期积累和富集大量的香味物质，在陈放过程中，大曲继续网罗空气和环境中的微生物使其微生物群落更加丰富，微生物菌群在整个发酵过程不断演替，充分利用高粱和大曲中的各类物质，形成醇厚丰满的酱香型白酒基酒2-4。大曲作为酿酒糖化剂，主要是提供多样的微生物用于产酒和风味物质的产生5，同时补充了生产过程中的淀粉含量，有利于提高白酒产量6。分析大曲微生物的多样性，可以更好的了解大曲中的微生物种类和数量，为酒类风味物质的形成和微生物的选育提供理论依据7
11、。第二代高通量测序技术可以更加精确、快速的分析样品中微生物结构，成为白酒生产过程中微生物菌群研究的主要手段8。在制曲中，发酵初期曲块处于常温状态，适宜酵母大量增殖，在发酵过程中，温度逐渐升高，酵母菌生长被抑制，在发酵中后期仅能少量或不能检出酵母，但是可检出大量细菌和霉菌等9；在堆积过程中，初期主要是酵母的富集过程，在堆积前后酵母数量明显增加，且增加幅度有13个数量级，增加幅度因堆积轮次和车间不同而略有差异10-12。仁怀产区现阶段对酱香白酒生产工艺已经建立较完整的团体标准，但未从酱香白酒生产过程微生物菌落演替方面诠释酱香白酒生产过程中风味物质的产生和积累。探明大曲中微生物的种类和数量，是探究酱
12、香白酒风味形成不可或缺的一部分。以陈放1个月、4个月、6个月的大曲为研究对象，探究陈放不同时间大曲中的菌群结构，为后续探究酱香白酒风味形成夯实基础，对仁怀酱香型白酒产业的发展具有重要的意义，并为地方产业的推进及进步提供科学依据。1材料与方法1.1材料、试剂及仪器原料：1个月、4个月、6个月黄曲、黑曲、白曲分别命名为：XH、XK、XB、FH、FK、FB、SH、SK、SB，大曲样品来自贵州茅台镇北街酒厂(集团)有限责任公司曲房陈放大曲，将所得大曲粉碎后用四分法进行缩分取样、备用。试剂：试剂盒Illmina公司Hiseq Rapid SBS Kitv2(FC-402-4023 500 Cycle)等
13、。仪器设备：PCR扩增仪（2720），美国应用生物系统公司；电泳仪（DYY-6C），北京六一生物科技有限公司；凝胶成像系统（BG-gdsAUTO(130)），北京百晶生物技术有限公司。1.2实验方法酱香大曲样品由四川帕诺米克生物科技有限公司测序，PE250测序方式，采用Qiagen Powersoilpro 试 剂 盒 提 取 黄 曲、黑 曲 和 白 曲 样 品 中 的DNA。在细菌 16S rDNA V4 区域进行扩增，扩增引物 Primer5-3：515F(5-GTGYCAGCMGCCGC-GGTAA-3)和 806（5-GGACTACHVGGGTWTC-TAAT-3），PCR 扩增用酶为
14、 TOYOBO KO EPlus-Neo DNA Polymerase（KOD-401B），扩增体系为50 L：5 L10PCR Buffer for KOD-Plus-Neo，5 L2 mmol/L dNTPS，3 L 25 mmol/L MgSO4，1.5 L上游 引 物 U515F，1.5 L 下 游 引 物 U806R，1 LKOD-Plus-Neo(1U/L)，2 L DNA模板，31 L超图1部分大曲整体图片李朝云，唐平华，罗平，付宇豪，曾祥卫，佘露露 基于高通量测序对不同陈放时间大曲细菌群落特征研究3333酿酒科技2023年第4期（总第346期）LIQUOR-MAKING SCI
15、ENCE&TECHNOLOGY2023 No.4(Tol.346)纯水。PCR扩增反应条件为预变性94 1 min，1个循环；变性 94 20 s，退火 54 30 s 和延伸72 30 s，2530个循环；72 5 min，1个循环；4 保温。每个样本进行3次PCR技术重复，取线性期PCR产物等量混合后用于后续建库13。扩增产物纯化后用2%的琼脂糖凝胶，每个样本进行3次重复，取线性期PCR产物等量混合后用NEW ENGLAND BioLabs 公 司 NEBNext Ultra IIDNA Library Prep Kit for Illumina建库。进一步在Illumina HiSeq
16、2500测序平台开展高通量测序。1.3数据处理与分析高通量测序所得序列通过FLASH拼接双端序列、过滤去除低质量序列，基于Uchime算法和gold数据库去除嵌合体，得到有效数据 Effiective Tag。基于Usearch软件，使用UPARSE算法在97%的一致性水平上进行Operational Taxonomic Unit（OUT）聚类。基于UCLUST分类法与SILVA数据库进行基因序列比对和注释分析。使用R语言和ggplot2包作图。2结果与分析2.1多样性分析通过 Usearch 算法在 97%的一致性水平上进行OTU聚类。计算Chao指数和ACE指数（以确定物种丰富度）、Shannon指数和Simpson指数（以确定物种多样性）及检测到的物种数目，以描述样品中的细菌菌群多样性，分析测序指数结果见表1。随着样本测序深度的增加，各大曲样品的真菌测序Shannon指数和Simpson指数都呈现逐渐平缓的变化趋势，说明测序数据结果已经覆盖绝大部分真菌，测序数据量合理、测序深度足够。可以看出随着大曲陈放时间延长，大曲中真菌多样性呈增长趋势，各个样品的Coverage指数均达到了9
