1、淡水渔业，2023，53(2):12 20Freshwater Fisheries2023 年 3 月Mar.2023收稿日期:2022-04-26;修订日期:2022-09-13资助项目:农业农村部休闲渔业重点实验室开放基金项目第一作者简介:胡宗云(1980)女，高级工程师，主要从事淡水养殖方面研究。E-mail:huzongyun2004163 com通讯作者:杨培民。E-mail:pmyang313163 com基于线粒体 COI 和 D-loop 序列的黑龙江流域蛇种群遗传结构分析胡宗云1，杨培民1，宋红梅2，牟希东2(1 辽宁省淡水水产科学研究院，辽宁省水生动物病害防治重点实验室，辽
2、宁辽阳 111000;2 中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业农村部休闲渔业重点实验室，广州 510380)摘要:以线粒体 COI 和 D-loop 序列为分子标记，基于88 个样本研究了黑龙江流域 3 个蛇(Saurogobio dabryi)种群的遗传多样性和遗传结构。结果表明，比对剪切后的 COI 和 D-loop 序列长度分别为 582 583 b、834 583 b，基于 COI 序列总体的单倍型多样性(0 377 3)略低于基于 D-loop 序列的单倍型多样性(0 577 0)，但基于两个序列总体的核苷酸多样性指数相等，且仅有0 000 9。群体间遗传距离分别为0 000 9(
3、COI)和0 000 9 0 001 0(D-loop)，群体间遗传分化指数分别为 0 004 9 0 007 6(COI)和 0 002 8 0 011 4(D-loop)，遗传分化均不显著(P 0 05)。分子方差分析(AMOVA)显示，群体内遗传变异占总变异的 100 02%(COI)和 99 49%(D-loop)，总的遗传变异主要源自群体内。单倍型系统发育树和 TCS 网络图表明，所有的单倍型随机地聚集在一起，没有形成明显的地理格局。中性检验和核苷酸错配分析显示，3 个蛇群体历史上发生过种群扩张事件。综上，3 个蛇群体遗传多样性水平相对较低，群体间没有显著的遗传分化，可以将 3 个群
4、体视为一个遗传管理单元。这些发现将丰富蛇现有的遗传信息，并为制定黑龙江流域蛇资源保护策略提供参考。关键词:蛇(Saurogobio dabryi);COI;D-loop;遗传多样性;遗传结构中图分类号:S9174文献标识码:A文章编号:1000-6907-(2023)02-0012-09蛇(Saurogobio dabryi Bleeker)，俗称船钉子，隶属于鲤科(Cyprinidae)亚科(Gobioninae)蛇属(Saurogobio)，广泛分布于中国、俄罗斯、朝鲜半岛和越南北部，中国境内除西北少数地区外，几乎遍布全国各主要水系1。蛇肉味鲜美、营养丰富，一些地区市场售价高达60 元/k
5、g2，属于高价值经济鱼类。近年来，受环境污染、酷渔滥捕、水利建设等人为活动影响，蛇自然资源量大幅衰减3，生境破碎化趋势明显4。为保护、开发和利用这一名特优物种种质资源，一些学者开展了繁殖生物学5 8、人工繁殖技术2，9、肌肉营养10、食性分析11、种群遗传学4，12 和分子标记开发13，14 等方面的研究。这些研究多集中在蛇的长江种群，而有关东北地区蛇的遗传多样性、种群遗传结构的研究还未见报道。线粒体 DNA 分子标记是核基因组分子标记的重要补充，已广泛用于水产动物的系统发育、生物地理学和保护生物学研究15。细胞色素氧化还原酶 I(COI)基因位于 mtDNA 的蛋白质编码区，进化速率适中，在
6、物种分子系统演化和分类中应用较多;而 D-loop 序列属于非编码区，是 mtDNA 进化速度最快的区域，常用于鱼类进化生物学和群体遗传学研究。本研究测定、分析了黑龙江流域 3 个蛇群体的 COI 和 D-loop 序列，研究了其遗传多样性水平和群体间遗传分化程度，以期为东北地区蛇种质资源保护提供理论依据。1材料与方法11材料2020 年 4 月至 2021 年 5 月，采用地笼网和挂网采集了 3 个群体 88 尾野生蛇样本，其中抚远群体 30 尾(黑龙江水系，标记为 FY)、饶河群体 29尾(乌苏里江水系，标记为 H)、榆树群体 29 尾(松花江水系，标记为 YS)(表1)。样本体长为 13
7、23 cm，体重为 16 51 g。每尾剪取鳍条 1 2 g，保存于 95%酒精内带回实验室。DOI:10.13721/ki.dsyy.2023.02.001第 2 期胡宗云等:基于线粒体 COI 和 D-loop 序列的黑龙江流域蛇种群遗传结构分析表 1蛇样品来源信息Tab 1The source information on samples of longnose gudgeon S dabryi Bleeker群体所属河流取样时间采集地经纬度样品数FY黑龙江2020 年 4 月黑龙江省佳木斯市抚远市浓桥镇 N481158 36;E134171 28”30H乌苏里江2020 年 5 月黑龙
8、江省双鸭山市饶河县八五九农场 N472013 50;E134910 4229YS松花江2021 年 5 月吉林省长春市榆树市培英街道 N445013 35;E1263730 502912方法1 2 1DNA 提取、PC 扩增及测序取鳍条 0 1g 左右，利用天根生化科技有限公司的基因组提取试剂盒(DP304)，按照试剂盒说明书提取总 DNA。COI 序列扩增引物为 C-F(5-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3)和 C-(5-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3)16，D-loop 序列扩增引物为 D-F(5-CTAACTCCCAAAGCTAGAATT
9、CT-3)和D-(5-ATCTTAGCATCT-TCAGTG-3)17，上述引物均由生工生物(上海)有限公司合成。PC 反应体系为 25 L:含 2 5 L10 PC buffer(Mg2+plus，20 mmol/L)、2 LdNTP mix(2 5 mmol/L)、0 25 L Taq DNA poly-merase(5 U/L)、上下游引物各 1 L(10 mol/L)、模板 1 L，双蒸水补足至 25 L。PC 扩增条件为:94 预变性5 min;35 个循环，每个循环包括 94 变性1 min，56 退火1 min，72 延伸1 min 30 s;最后 73 总延伸 10 min。本
10、研究所有的 PC 反应均在 ABI 9700 扩增仪上进行，扩增产物经 1 2%琼脂糖凝胶电泳检测，获得目的条带的产物于 20 冰箱内保存备用。PC 产物送至生工生物(上海)有限公司进行纯化，并由 ABI 3730全自动测序仪双向测序，测序引物为上述 PC 扩增引物。1 2 2数据处理测得的序列经 BioEdit 编辑去除两端低质量的碱基，然后在 NCBI 网站上进行比对，留取与蛇线粒体基因组(KF534790 1、KF612272 1)COI 和D-loop 序列同源性 99%以上的序列。运用 MEGA6 0软件包中的 Alignment by ClustalW 程序对留取的序列进行比对和剪
11、切，并计算序列碱基组成、变异位点数和转换与颠换值;采用邻接法(Neighbor-Joining)，基于 Kimura 双参数法(Kimura 2-parame-ter，K2p)模型构建单倍型进化树。利用 DnaSP6 0软件统计两个基因的单倍型数、单倍型多样性(h)、平均核苷酸差异数(K)及核苷酸多样性()。应用 Arlequin 3 5 软件进行中性检验，并用其分子方差分析(AMOVA)方法计算遗传变异在群体内和群体间的分布及群体间遗传分化系数(Fst)，1 000次重复随机抽样重排后进行显著性检验，以 P 0 05作为差异显著性水平。利用 Popart 1 7软件构建 TCS 单倍型网络图
12、。2结果21序列组成与遗传多样性分析COI 和 D-loop 序列经比对剪齐后，分别获得了长度为 582 583 bp COI 和 834 835 bp D-loop 的同源序列(表2)。COI 同源序列中共检测出 15 个变异位点，其中简约信息位点 12 个，单突变位点 3个，一共定义了 13 个单倍型;平均碱基组成:A=28 7%、T=23 2%、G=28 9%、C=19 2%，A+T 含量(52%)大于 G+C 含量(48%);平均转换/颠换值为 9 8。D-loop 同源序列中共检测到 14个变异位点，包括 9 个简约信息位点和 5 个单突变位点，定义单倍型 15 个，平均碱基组成:A
13、=32%、T=31 9%、G=14 4%、C=21 8%，A+T 含量(64%)大于 G+C 含量(36%);平均转换/颠换值为 4 6。COI 和 D-loop 碱基组成均呈较明显的AT 偏好。3 个群体 COI 基因片段总体单倍型多样性、核苷酸多样性和核苷酸差异数分别为0377 3、0000 9和0510 4;各群体的单倍型多样性指数为 0 330 70 406 2，单倍型多样性指数大小顺序为 YS H FY;核苷酸多样性指数均为 0 000 9(表2)。3个群体 D-loop 序列总体单倍型多样性、核苷酸多样性和核苷酸差异数分别为 0 577 0、0 000 9 和0 780 4;各群体
14、的单倍型多样性指数和核苷酸多样性指数分别介于 0 492 0 0 692 0 和 0 000 8 0 001 1;群体间 D-loop 单倍型多样性指数、核苷酸多样性指数大小顺序一致，均为 YS H FY。3 个群体基于 COI 和 D-loop 序列的遗传多样性指数相近，单倍型多样性、核苷酸多样性指数处于较低31淡水渔业2023 年水平，样本间两个序列的核苷酸差异较小。22遗传距离和遗传分化用 Kimura 双 参 数 法(Kimura 2-parameter，K2p)计算 3 个群体间遗传距离和遗传分化指数如表 3 所示。基于 COI 序列的分析结果显示，3 个群体的群体内和群体间遗传距离
15、相等，均为0 000 9;3 个群体的群体间遗传分化指数 0 004 9 0 007 6。基于 D-loop 序列的计算结果表明，3 个群体的群体内遗传距离为 0 008 0 0 010 0，大小顺序为 H=YS FY;群体间遗传距离为0 000 90 001 0，YS 与 FY 群体间遗传距离和 FY 与 H群体间遗传距离相等(0 000 9)，略小于 YS 与 H群体间的遗传距离(0 001 0);3 个群体间的遗传分化指数介于 0 002 8 0 011 4。3 个群体基于COI 和 D-loop 序列的遗传距离、遗传分化指数较小，预示 3 个群体间遗传差异较小，遗传分化不明显。基于 C
16、OI 序列的分子方差分析(AMOVA)显示，群体内遗传变异占遗传变异的 100 02%，远大于群体间遗传变异(0 02%);基于 D-loop 序列 AMOVA 分析同样显示，群体内的遗传变异占比(99 49%)也远大于群体间遗传变异(0 51%)。基于 COI 和 D-loop 序列的分子方差分析表明，3 个蛇群体整体遗传变异几乎全部来自群体内，群体间遗传变异占比极小(表4)。表 2蛇3 个群体 COI 和 D-loop 基因的遗传多样性参数Tab 2Genetic diversity parameters of COI and D-loop genes in three populations of longnose gudgeon S dabryi Bleeker遗传多样性参数COIFYHYS总体D-loopFYHYS总体序列长度582 583582 583582 583582 583835835834 835834 835变异位点数5771568914单一突变位点数46733565简约突变位点数110123339单倍型数67513791015单倍型多样性0 330 70 404
