1、第 51 卷分析化学（FENXI HUAXUE）研究报告第 2 期2023 年 2 月Chinese Journal of Analytical Chemistry229238DOI:10.19756/j.issn.0253-3820.221183超高效液相色谱-串联质谱法测定尿液中4种环己烷1,2-二甲酸二异壬基酯增塑剂代谢物韩林学1邱天1林潇1刘嘉融2胡小键1张续*11（中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所，环境与人群健康重点实验室，北京 100021）2（首都医科大学燕京医学院，北京 101300）摘要建立了尿液中 4 种环己烷 1,2-二甲酸二异壬基酯（DINCH）增塑剂代谢物
2、的超高效液相色谱-串联质谱测定方法。2 mL 尿液经-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶水解，采用阴离子交换固相萃取柱对目标分析物进行富集净化，氮吹浓缩至 0.5 mL。以Acquity BEH C18色谱柱（100 mm2.1 mm，1.7 m）作为分析柱，0.05%乙酸乙腈和 0.05%乙酸作为流动相进行梯度洗脱，在电喷雾负电离多反应监测模式下进行定性和内标法定量分析。4 种 DINCH 代谢物在 0.0150 ng/mL 浓度范围内线性关系良好，相关系数（r）大于 0.9996，方法检出限为 0.010.03 ng/mL，方法定量限为 0.030.10 ng/mL，加标回收率为 74%124%，
3、相对标准偏差为 1.2%15.0%，日内精密度为 3.5%6.2%，日间精密度为 6.9%9.8%。应用此方法测定了 55 份尿液样本，结果显示，4 种DINCH 代谢物均可检出。MINCH、oxo-MINCH、OH-MINCH 和 cx-MINCH 的检出率分别为 18.2%、47.3%、98.2%和 100%，检出浓度分别为MDLs 0.7 ng/mL、MDLs 5.7 ng/mL、95%；乙腈（ACN）、甲醇（MeOH）、乙酸乙酯（EAC）（HPLC 级，德国 Merck 公司）；-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶（来源于莱曼蜗牛，85000 U/mL，美国Sigma 公司）；乙酸（HPLC
4、级，美国 Tidea 公司）；乙酸铵（MS 级，美国 Thermo Fisher 公司）；28%氨水（V/V，HPLC 级，上海 Dasma-beta 公司）。实验用水为超纯水（18.2 Mcm）。1.2标准溶液的配制混合标准储备液准确移取 4 种 DINCH 代谢物单标溶液各 1.00 mL 至容量瓶中，用乙腈定容至10.0 mL，4 保存 24 h，使其充分混合溶解。将上述混合标准储备液分装到 2 mL 安瓿瓶中，封口，4 保存。此混合标准储备液浓度为 10.0 g/mL。混合内标储备液采用上述相同标准配制方法，获得 4 种DINCH 代谢物同位素内标的混合标准溶液（10.0 g/mL），
5、4 保存;使用时，将混合内标储备液用甲醇稀释至 100 ng/mL 使用。混合标准工作液：用乙腈将混合标准储备液稀释至 1.0 g/mL，再用 10%乙腈逐级稀释，配制成 0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10 和 50 ng/mL 的 4 种 DINCH 混合标准工作液，内标质量浓度为 20 ng/mL，现配现用。1.3样品采集和前处理在北京市范围内采集了 55 名志愿者的尿液样本（男性 15 份，女性 40 份）。在采样前，所有志愿者均签署知情同意书。采样后，样品储存于80 待用。本研究获得中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所伦理审查委员会的批准（批准号：202133）。
6、将尿液振荡混匀，取 2 mL 尿液至 5 mL 离心管。依次向尿液中加入 500 L 乙酸铵溶液（1 mol/L，pH=6.5）、10 ng 内标、10 L-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶。样品混匀后，37 下酶解 2 h。酶解后向样品中加入 100 L 氨水，振荡 30 s，4 条件下以 5000 r/min 离心 10 min，将上清液移出，进行样品富集净化。依次用 3 mL 甲醇和 3 mL 水活化固相萃取柱；将上清液过柱（流速控制在 1 drop/s）；依次用 3 mL水和 3 mL EAC 快速淋洗；空气抽干 20 s，用 2 mL 含 1%甲酸的 ACN-EAC（1:1，V/V）缓慢洗
7、脱，洗脱液经氮吹浓缩至 200 L 时，加入 50 L 水作为保护剂，避免样品吹干，之后继续浓缩至 50 L。最后加入450 L 10%（V/V）乙腈复溶样品，5000 r/min 离心 10 min，上机测定。230分 析 化 学第 51 卷1.4仪器分析条件液相色谱条件采用 Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm2.1 mm，1.7 m）进行液相分离；流动相 A为 0.05%乙酸（V/V），B为0.05%乙酸乙腈（V/V）；流速：0.3 mL/min；进样量：10 L；柱温：40。梯度洗脱：02 min，95%A；28 min，95%5%A；810 min，5%A；101
8、0.5 min，5%95%A；10.515 min，95%A。质谱条件电喷雾离子源，负电离模式（ESI）；气帘气（CUR）：207 kPa；碰撞气（CAD）：中等；离子源温度（TEM）：500；雾化气（GS1）：345 kPa；辅助加热气（GS2）：413 kPa；喷雾电压（IS）：4500 V；扫描时间：50 ms。4种DINCH代谢物及其同位素内标的母离子、子离子及碰撞电压等参数见表1。2结果与讨论2.1质谱条件的优化将 DINCH 代谢物及其同位素内标的单标储备液用甲醇稀释至 50 ng/mL，采用针泵进样模式将 8 种目标分析物单标溶液以 15 L/min 的流速进入质谱仪。在 ESI
9、 源下用正、负两种电离模式进行母离子扫描。结果显示，负电离模式下各目标分析物的质谱响应信号明显高于正电离模式。如图 1 所示，在负电离模式下，各目标分析物均生成Mw1的母离子。在确定各目标分析物的母离子后，依次进行子离子扫描。各目标分析物选择最优的 2 个特征碎片离子作为定量离子和定性离子，同时优化各目标分析物的碰撞能（CE）和去簇电压（DP）。最后再配制 10 ng/mL 的目标分析物混合标准溶液，在 MRM 模式下优化CUR、CAD 和 TEM 等质谱参数。2.2液相条件的优化2.2.1色谱柱的选择DINCH 代谢物测定主要参考美国疾病预防控制中心 Schutze 等20建立的方法，该方法
10、采用苯基柱（Phenyl）对DINCH 代谢物进行液相分离。因此，本研究以乙腈和水作为流动相，比较了BEH Phenyl、CSHFluoro Phenyl、xBridge Phenyl 和 BEH C18柱对 4 种 DINCH 代谢物的分离效果，结果如图 2A2D 所示。MINCH 在 3 种苯基柱中的峰形优于 BEH C18柱，但 cx-MINCH 在苯基柱的分离效果较差，峰形拖尾严重。而在同一流动相及梯度洗脱条件下，4 种 DINCH 代谢物在 BEH C18柱上均表现出较好的质谱响应信号。此外，相较于苯基柱，4 种目标分析物在 BEH C18柱上的保留时间更短。因此，后续实验选用BEH
11、 C18柱对 4 种目标分析物进行分离。表14种DINCH代谢物及其同位素内标的质谱参数Table 1Mass spectrometry parameters of four kinds of metabolites of di(isononyl)cyclohexane-1,2-dicarboxylate(DINCH)andisotope internal standards序号No.化合物Compounds分子式Chemical formula母离子Precursor ion/(m/z)子离子Product ion/(m/z)碰撞能Collision energy/eV去簇电压Declust
12、ering potential/V1MINCHC17H30O4297.1153.0*/109.019/34302oxo-MINCHC17H28O5311.4153.0*/109.020/33403OH-MINCHC17H30O5313.4153.1*/109.023/36404cx-MINCHC17H28O6327.1173.1*/152.921/2850513C4-MINCH13C4C13H30O4301.2157.121/3330613C4-oxo-MINCH13C4C13H28O5315.2157.119/3240713C4-OH-MINCH13C4C13H30O5317.2157.22
13、3/3440813C4-cx-MINCH13C4C13H28O6331.2173.221/2845注：MINCH：环已烷-1,2-二羧酸，单-(4-甲基辛基)酯；oxo-MINCH：环已烷-1,2-二羧酸，单-(4-甲基-7-氧羰基)酯；OH-MINCH：环己烷-1,2-二羧酸，单-(7-羟基-4-甲基辛基)酯；cx-MINCH：环己烷-1,2-二羧酸，单-(7-羧基-4-甲基庚基)酯；*标记的为定量离子。Note:MINCH:Cyclohexane-1,2-dicarboxylic acid,momo-(4-methyl octyl)ester;oxo-MINCH:Cyclohexane-1
14、,2-dicarboxylic acid,momo-(4-methyl-7-oxooctyl)ester;OH-MINCH:Cyclohexane-1,2-dicarboxylic acid,momo-(7-hydroxy-4-methyl octyl)este;cx-MINCH:Cyclohexane-1,2-dicarboxylic acid,momo-(7-carboxy-4-methyl heptyl)ester;*indicating quantitative ion.第 2 期韩林学等：超高效液相色谱-串联质谱法测定尿液中4种环己烷1,2-二甲酸二异壬基酯增塑剂代谢物2312.2.
15、2流动相的选择与优化采用 BEH C18柱作为分析柱，分别在甲醇-水和乙腈-水两种流动相体系下比较目标分析物在两种流动相体系下的色谱峰形和保留时间。如图 2D 和 2E 所示，在两种流动相体系下，均存在目标分析物色谱峰拖尾现象。但是，以甲醇为流动相时，cx-MINCH 色谱峰宽拖尾更严重。此外，在相同的梯度洗脱条件下，目标分析物在甲醇-水流动相中的保留时间更长，以甲醇-水作为流动相时更耗时。因此，选用乙腈-水作为流动相。本研究组的前期研究结果表明，向流动相中加入适量乙酸可抑制羧基化合物解离，增强目标化合物在色谱柱上保留，改善色谱峰形23。因此，向流动相体系中加入 0.05%（V/V）和 0.1
16、%（V/V）乙酸，比较不同乙酸添加比例对色谱分离的影响。如图 2F 所示，乙酸可显著改善目标分析物在色谱柱上的分离效果。随着乙酸浓度增加，4 种目标分析物的半峰宽逐渐变窄，色谱峰尖锐且对称。同时，实验发现，乙酸对4 种 DINCH 代谢物的质谱响应信号表现出不同的影响。其中，OH-MINCH、oxo-MINCH 和 cx-MINCH 这3 种 DINCH 代谢物质谱响应信号存在一定的抑制作用。在流动相中添加乙酸后，3 种 DINCH 代谢物的质谱响应降低 15%39%，并且随着乙酸添加比例增加，抑制效应逐渐明显。相反，乙酸对 MINCH 的质谱响应信号却存在增强效应，在两种添加比例下，其质谱响应信号增强了 4.95.2 倍。因此，选择 0.05%乙酸-乙腈体系作为流动相进行梯度洗脱。2.3前处理条件的优化2.3.1固相萃取柱的选择目标分析物的提取效率（Extraction efficiency，EE）和基质效应（Matrix effects，ME）是评估前处理方法的重要指标。本研究选择 3 种固相萃取柱 HLB、MAX 和 MCX，按照产品的标准固相萃取程序处理实15020025030
