1、第 32 卷，第3 期2023 年3 月化学分析计量CHEMICAL ANALYSIS AND METERAGEVol.32,No.3Mar.2023超高效液相色谱法分析淡豆豉配方颗粒中3种异黄酮周颖1，依泽1，祝清岚1，郑成1，昝珂2（1.浙江省食品药品检验研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，杭州310052；2.中国食品药品检定研究院，北京102629）摘要建立超高效液相色谱法同时测定淡豆豉配方颗粒中3种异黄酮（大豆苷元、黄豆黄素、染料木素）的含量。选择Eclipse Plus C18 RRHD色谱柱（100 mm2.1 mm，1.8 m），流动相为乙腈-0.1%乙酸溶液，
2、梯度洗脱，流量为0.3 mL/min，柱温为30，检测波长为260 nm。大豆苷元、黄豆黄素、染料木素的质量浓度分别在18.41184.14、0.484.82、30.65306.46 g/mL范围内线性关系良好（r0.999 9）。样品测定结果的相对标准偏差分别为1.80%、2.20%、1.71%（n=6），平均加标回收率分别为96.49%、100.93%、98.53%。该方法快速，准确、可靠，可为淡豆豉配方颗粒的质量控制提供参考。关键词淡豆豉配方颗粒；异黄酮；大豆苷元；染料木素；黄豆黄素；超高效液相色谱法中图分类号：O657.7 文献标识码：A 文章编号：1008-6145(2023)03-
3、0026-04Determination of three isoflavonoids in Sojae Semen Praeparatum formula granules by UPLCZHOU Ying1,YI Ze1,ZHU Qinglan1,ZHENG Cheng1,ZAN Ke2(1.Zhejiang Institute for Food and Drug Control,State Drug Administration Key Laboratory for Quality Evaluation of Proprietary Chinese Medicines,Hangzhou3
4、10052,China；2.National Institutes for Food and Drug Control,Beijing102629,China)Abstract A UPLC(Ultra-high performance liquid chromatography)method was established for the simultaneous determination of three isoflavonoids(daidzein,glycitein and genistein)in Sojae Smen Praeparatum formula granules.Th
5、e analysis was performed on an Eclipse Plus C18 RRHD column(100 mm2.1 mm,1.8 m),with the mobile phase comprising of acetonitrile-0.1%acetic acid flowing at 0.3 mL/min in a gradient elution manner,and the detection wavelength was set at 260 nm.The mass concentration of daidzein,glycitein and genistei
6、n showed good linear relationships in the ranges of 18.41-184.14,0.48-4.82,and 30.65-306.46 g/mL(r0.999 9),respectively.The relative standard deviations of the detection results were 1.80%,2.20%,1.71%(n=6),and the average recoveries were 96.49%100.93%,98.53%for daidzein,glycitein and genistein,respe
7、ctively.This rapid,feasible,accurate and reliable method can be used for the quality control of Sojae Smen Praeparatum formula granules.Keywords Sojae Semen Praeparatum formula granules;isoflavonoids;genistein;daidzein;glycitein;UPLC淡豆豉配方颗粒为豆科植物大豆的干燥成熟种子(黑豆)的发酵加工品经炮制加工制成的配方颗粒，是淡豆豉发酵品与时俱进的产物。淡豆豉具有解表、
8、除烦、宣发郁热的功效，临床用于感冒、寒热头痛、烦躁胸闷、虚烦不眠1。化学成分研究表明，淡豆豉中主要含有大豆苷元、染料木素、黄豆黄素等异黄酮类成分27。大豆苷元具有显著的抗菌活性和降血糖作用89，黄豆黄素具有促成骨细胞增殖以及诱导人胃癌AGS细胞凋亡能力1011，染料木素具有明显降血脂、抗肿瘤、抗氧化、抗肝纤维化和抗骨质疏松等药理活性1216。目前国家药监局已经结束中药配方颗粒试点工作，后期将通过强化中药配方颗粒的整体质量控制水平，继续保障中药配方颗粒质量，多措施并举引导行业健康发展。中药配方颗粒国家标准中尚未对淡豆豉配方颗粒的主要异黄酮成分含量作出全面规定，笔者利用doi:10.3969/j.
9、issn.1008-6145.2023.03.006基金项目浙江省药品监督管理局计划项目（2021001）通信作者昝珂，博士，副研究员，从事中药质量研究收稿日期20230106引用格式周颖，依泽，祝清岚，等.超高效液相色谱法分析淡豆豉配方颗粒中3种异黄酮 J.化学分析计量，2023，32（3）：26.ZHOU Ying,YI Ze,ZHU Qinglan,et al.Determination of three isoflavonoids in Sojae Semen Praeparatum formula granules by UPLCJ.Chemical Analysis and Met
10、erage,2023,32(3):26.26周颖，等：超高效液相色谱法分析淡豆豉配方颗粒中3种异黄酮超高效液相色谱(UPLC)法同时测定淡豆豉配方颗粒中大豆苷元、染料木素、黄豆黄素3种异黄酮类成分，为淡豆豉配方颗粒质量控制提供参考依据。1实验部分1.1主要仪器与试剂超高效液相色谱仪：Ultimate3000型，赛默飞世尔科技(中国)有限公司。电子天平：XPE-2015型，感量为0.01 mg，梅特勒-托利多仪器上海有限公司。超声波清洗器：KQ300VDE型，昆山超声仪器有限公司。纯水仪：Milli-Q A10型，美国密理博公司。淡豆豉配方颗粒样品：3批，某制药生产企业样品，分别标记为S1S3。
11、大豆苷元：批号为MUST-17101202，纯度(质量分数)不小于98%，成都曼思特生物科技有限公司。染料木素：批号为111704201703，纯度(质量分数)为99.5%，中国食品药品检定研究院。黄豆黄素：批号为ST03980120，纯度(质量分数)不小于98%，上海诗丹德标准技术服务有限公司。乙腈：色谱纯，德国默克集团。甲醇、乙酸：分析纯，国药集团化学试剂(北京)有限公司。实验用水为超纯水。1.2溶液配制单一对照品储备液：精密称取大豆苷元、黄豆黄素、染料木素对照品适量，分别置于容量瓶中，用甲醇溶解并定容成单一对照品储备液，质量浓度分别为0.921、0.096、0.613 mg/mL。混合对
12、照品溶液：分别精密吸取上述各单一对照品储备液适量，置于同一容量瓶中，用70%甲醇溶液（体积分数，下同）稀释成大豆苷元、黄豆黄素和染料木素质量浓度分别为 184.142、4.819、306.460 g/mL的混合对照品溶液。样品加标用对照品溶液：分别精密吸取上述各单一对照品储备液适量，置于同一容量瓶中，加70%甲醇溶液稀释成含大豆苷元、黄豆黄素、染料木素质量浓度分别为0.368、0.116、0.613 g/mL的加标回收用对照品溶液。1.3样品处理取淡豆豉配方颗粒样品适量，研细，取约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇溶液25 mL，称定质量，超声处理(功率250 W，频率4
13、0 kHz)30 min，取出，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，得样品溶液。1.4色谱条件色谱柱：Eclipse Plus C18 RRHD柱(2.1 mm100 mm，1.8 m，美国安捷伦科技有限公司)；流动相：乙腈(A)-0.1%乙酸溶液(B)，流量为0.3 mL/min；梯度洗脱程序：025 min 为 15%34%A，2526 min为34%90%A，2629 min为90%A；柱温：30；检测器：二极管阵列检测器；检测波长：260 nm。2结果与讨论2.1检测波长选择采用二极管阵列检测器在200400 nm波长范围内对单一对照品储备液进行扫描，大
14、豆苷元、黄豆黄素、染料木素的吸收光谱图分别见图1图3。由图1图3可知，大豆苷元最大吸收峰为250 nm，黄豆黄素、染料木素分别在259 nm和262 nm左右有最大吸收峰，综合考虑，选择260 nm作为大豆苷元、黄豆黄素、染料木素的检测波长。2.2色谱条件优化通过改变色谱条件对样品溶液进行分析，以考察色谱条件的变化对测定结果的影响。色谱条件变化如下：(1)分别采用高效液相色谱(HPLC)法17、超高效液相色谱（UPLC）法对出峰时间、分离度、检测灵敏19025030035040001020304050192250吸光度波长/nm图1大豆苷元吸收光谱图1902503003504000102030
15、4050195259吸光度波长/nm图2黄豆黄素吸收光谱图19025030035040001020304050193262吸光度波长/nm图3染料木素吸收光谱图27化学分析计量2023 年，第 32卷，第 3 期度进行分析，相比于HPLC法，UPLC法出峰快，可缩短分析时间，大幅减少溶剂消耗，提高效率，色谱峰的分离效果较好，因此采用UPLC法。(2)分别设定流动相流量为0.2、0.3、0.5 mL/min进行试验。结果表明，当流动相流量为0.2 mL/min时，大豆苷元、黄豆黄素、染料木素出峰时间均滞后；当流动相流量为0.5 mL/min时，系统压力相对较高，影响色谱柱以及仪器各部件的使用寿命
16、；当流动相流量为0.3 mL/min时，各色谱峰分离度、峰形均较好，出峰时间、系统压力适宜，因此选择流动相流量为0.3 mL/min。(3)采用等度和梯度两种洗脱方式，当采用梯度洗脱时，不仅缩短了分析时间，还使得3种异黄酮类成分均达到较好的分离，因此采用梯度洗脱方式。(4)分别选择甲醇-0.1%乙酸、乙腈-水、乙腈-0.1%乙酸溶液作为流动相进行试验，当以乙腈-0.1%乙酸溶液作为流动相时，基线较为平稳，色谱峰分离效果满足检测要求，因此采用乙腈-0.1%乙酸溶液作为流动相。2.3样品提取条件的优化样品为颗粒剂，以编号为S3的样品为考察对象，对样品溶液的制备方法进行单因素考察，选择70%甲醇溶液、甲醇、70%乙醇溶液3种提取溶剂对样品进行提取，结果表明，当采用70%甲醇溶液作为提取溶剂时，色谱峰面积较大，说明提取较为完全，因此选择70%甲醇溶液为提取溶剂。以70%甲醇溶液为提取溶剂，进一步采用加热回流和超声波法对样品进行提取考察，结果表明，加热回流和超声波法所得色谱峰面积相当，说明2种方法提取效果比较接近，鉴于后者操作快捷简单，故选择超声波法作为样品的提取方法。分别选择超声处理15、30
