1、刘娜超临界流体色谱在天然产物分析的研究进展刘娜（武汉工程大学邮电与信息工程学院，湖北 武汉 430073）摘要：超临界流体色谱（Supercritical Fluid Chromatography，SFC）是一种绿色环保高效的分离技术，适于分离分析难挥发和热稳定性差的物质，流动相选择范围广且易得便宜，既可与气相色谱检测器联用也可与液相色谱检测器联用，弥补气相色谱和液相色谱的不足，对于复杂天然产物的分离纯化具备一定优势，对超临界流体色谱在天然产物分析的研究进行了综述。关键词：超临界流体色谱；分离纯化；天然产物中图分类号：R 284.1文献标志码：A文章编号：2095-817X（2023）01-0
2、033-0061 超临界流体色谱的原理超临界流体色谱（Supercritical Fluid Chromatography，SFC）是天然产物分析和纯化应用中一项绿色环保技术，天然产物化学成分复杂多样，主要是动物、植物、海洋生物和微生物产生的生物二次代谢产物及生物体内源性生理活性化合物 1。近年来，SFC 不再局限于非极性成分或中等极性成分的分析，对于蒽醌类、皂苷、酚酸和生物碱等极性天然产物均具备较好的分离效果，SFC 既不破坏天然产物的活性，又可快速分离，是一种高效的分离制备方 法。SFC 的原理与液相色谱的原理类似，本质上是以超临界流体作为流动相，以固体吸附剂（如硅胶）或键合在载体（或毛细
3、管壁）上的有机高分子聚合物作固定相的正相色谱 2。当物质在高于临界压力和临界温度时，此时的流体为超临界流体，具有气体的低黏度、液体的高密度以及介于气、液之间较高的扩散系数等特征 3。超临界流体容易控制和调节，在进入检测器前可以转化为气体、液体或保持其超临界流体状态，因此可与现有任何液相检测器（紫外检测器，蒸发光散射检测器，荧光检测器）或气相检测器（热离子检测器，火焰光度检测器）4相连接，能与多种类型检测器（电子俘获检测器，质谱检测器）相匹配，收稿日期：2022-09-19作者简介：刘娜（1987），女，讲师，主要研究方向：制药工 程。扩大了它的应用范围和分离能力，在定性、定量方面有较大的选择范
4、围。由于超临界流体黏度小，与同流速下高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）相比，柱压更小，因此使用小粒径填料更具优势，采用亚微米直径的填料，色谱分离可在更快的最佳流速下完成，并且比 HPLC易达到更高的柱效率和更高的分离度。SFC 中通常使用 CO2超临界流体作流动相，非极性 CO2只能有效萃取分子量较低的非极性的亲脂性物质，对极性化合物的溶解能力有限。通常需要在流动相中适量加入适当的非极性或极性溶剂作共同试剂，即夹带剂，也称改性剂，以此改变流动相的极性，提高流动相对化合物的溶剂化效果，增强流动相的洗脱能力。SFC 在分离和纯化
5、天然产物方面表现出众，因为它运行更快，溶剂用量更少，SFC 是气相色谱和液相的补充，SFC 可以解决气液色谱分析的难题，分析气相色谱难气化的不挥发性样品，具有比 HPLC更快的分离效率，与超临界流体萃取（Supercritical Fluid Extraction，SFE）联用 5可实现同时提取和分析样品。本综述按天然产物中不同化合物类别划分，主要从分离和检测条件讨论其局限性和优势，并与超高效液相色谱（Ultra High Performance Liquid Chromatography，UHPLC），多 维 色 谱 技 术（Multidimensional Gas Chromatograp
6、h，MDGC）等分离技术在天然产物分析进行比较，综述超临界流体色谱的现状和前景。33化 工 与 医 药 工 程第44卷第1期2023年2月出版Chemical and Pharmaceutical Engineering 2023，44(1)医药工艺与工程2 超临界流体色谱在天然产物分析的应用2.1 生物碱生物碱是一类含氮的碱性有机化合物（蛋白质、氨基酸、肽类及维生素 B 除外），大多数有复杂的氮环状结构，具有显著的生物活性和碱性 6，是中草药重要的有效成分之一，绝大多数生物碱以盐的形式存 在。异喹啉类生物碱（isoquinoline）是植物体中分布较广、结构类型复杂，数量较多的一类生物碱，J
7、iang ZM 7首次利用环保型低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvents，DESs）作为新型流动相添加剂，使用 SFC 分离和测定 10 种异喹啉生物碱（IsoQuinoline Alkaloid，IQAs），将 DESs 添加到流动相中时，可以明显观察到生物碱的分离度提高和峰拖尾减少。超临界 CO2 和 MeOH-2%H2O-0.5%FA-0.25%ChCl-Gly 用作优化的流动相，10 种 IQAs 在 SFC 中得到了很好的分离，分离机制可能归因于 DESs 被用作硅烷醇阻断剂以与二氧化硅表面上的 IQAs 竞争吸附位点。Huang Yang 8开发了 SFC 分离八种
8、 IQAs 的方法，与HPLC 相比，SFC 可以采用 13 倍的 HPLC 的分离速度进行分析。吲哚类生物碱（indoles）是生物碱中种类较多，结构较为复杂且多具生物活性的一大类生物碱，螺羟吲哚生物碱（Spiro Oxindole Alkaloids，SOAs）作为钩藤属植物的标志物，在极性或水性溶剂中通过逆曼尼希反应很容易发生异构化。Yang WZ 9采用 SFC 从大叶钩藤中分离钩藤碱/异钩藤碱，柯诺辛碱 B/柯诺辛碱 C 两对差向异构体，在非手性 Torus 1-AA 和 Torus Diol 色谱柱上，开发了两种等度洗脱 SFC 方法，流动相中添加乙腈用于溶解和作为 SFC 中的改
9、性剂，与反相 HPLC 不同，SFC 通过使用无水流动相（惰性 CO2 和非质子改性剂），为中药中互变异构质量控制参考标准的快速分析和分离提供了解决方案。喹啉类生物碱（quinolines）最初从茜草科金鸡纳属植物中分离得到，具有多种生物活性。Murauer，A 10建立 SFC 方法，不到 7 min 便成功分离二氢奎尼丁、二氢奎宁、奎尼丁、奎宁、辛可宁和辛可尼定，固定相 Acquity UPC2 Torus DEA 1.7 m 色谱柱，流动相为超临界 CO2（A）和 0.8%DEA-10%ACN-90%MeOH（B），方法重复性好，精密度高，回收率符合要求，本研究表明 SFC 适合分离天然
10、产物。2.2 蒽醌类醌类化合物是自然界中类别较大的天然活性成分之一，是许多天然药物如大黄、何首乌、丹参等药材的有效成分，从结构上以蒽醌类居多，以中药大黄为例，致泻作用是蒽醌类化合物的主要生物活性，蒽醌一般结合成苷存在于植物体中，极性较大，水溶性较强，分离和纯化相对比较困难。干燥大黄的根茎，具有多种药理作用，已广泛用于治疗多种疾病，开发一种环保的大黄成分分离方法对大黄的质量控制和药理研究具有重要意义。Aichner，D 11使用超临界 CO2和甲醇以及 0.05%二乙胺为流动相，其中甲醇调节溶剂极性，二乙胺改善峰对称性，最佳固定相为 Acquity UPC2 HSS C18 SB 1.8 m 柱
11、，以此建立 SFC 法从大黄中分离五种蒽醌（大黄酚、大黄素、大黄素甲醚，芦荟大黄素和大黄酸），五种蒽醌标准品分离时间不到 5 min。方法学验证结果表明该方法的重复性、回收率、精确度均符合规定，Aichner 认为，SFC 不仅适用于非极性物质，对于极性较强的蒽醌类化合物同样可行。Qin，XX 12 建立了一种利用 SFC 分离纯化大黄成分的方法。用20%的 H2SO4和苯回流提取大黄粉制备样品。以甲醇 4%（v/v）为改性剂，超临界 CO2为萃取剂，在YMC-Diol 柱上蒸发苯萃取物，经 SFC 分离得到萃取物。流动相流速 15 mL/min，柱压 13 MPa，柱温318 K。通过 SF
12、C 法得到了大黄酸和大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚五种羟基蒽醌。用 HPLC法测定所得化合物的纯度均在 97%以上，并用核磁共振和质谱对其化学结构进行了鉴定。2.3 大麻素大麻素（Cannabinoids），是从大麻里发现的一组萜酚类化合物，存在于动物神经和免疫系统里。脱羧是有效生产大麻中 9-四氢大麻酚（9-THC），大麻二酚（CBD）、大麻环萜酚（CBC）、大麻萜酚（CBG）等主要活性成分的重要步骤，这些大麻素在大麻中含量不高，但可通过其相应酸四氢大麻酚酸（THCA）、大麻二酚酸（CBDA）、大麻环萜酚酸（CBCA）的脱羧作用形成。这些酸性大麻素热不稳定，当暴露在光或热下时，通过吸
13、烟、烘烤可以脱羧。9-THC 本身在脱羧过程中很容易在氧气和光的作用下氧化成大麻酚（CBN），为了了解植物大麻素可能发生的脱羧反应，需要建立有效的分析方法来确定脱羧反应物（酸性大麻素）和产物（中性大麻素）34化 工 与 医 药 工 程第44卷第1期2023年2月出版Chemical and Pharmaceutical Engineering 2023，44(1)随时间的浓度变化，有效的分析方法对于同时检测中性和酸性大麻素至关重要。Mei Wang 13发现气相色谱（GC）中不进行脱羧或衍生化，不稳定酸无法通过 GC 进行分析，GC 进样口将 THCA-A 转化为 9-THC 也并不理想，9-
14、THC 的生成在 225 下达到最大，但转化率仅为65%，在 300 下，观察到 9-THC 显著损失，未观察到可能的氧化产物 CBN。液相色谱（LC）是另一种常用于脱羧研究的色谱技术，酸性或中性大麻素的 HPLC/DAD 分析的主要问题是这些成分的摩尔吸光度较低，检测限较高，洗脱液的背景吸收率通常较高，通过 HPLC/MS 可改善。HPLC/DAD 测得的 9-THC 和 THCA-A 的摩尔和始终高于通过 GC测得的 9-THC 总量，表明脱羧反应不完全。Mei Wang 利用 UHPSFC/PDA-MS 分析中性和酸性大麻素，确定大麻提取物中植物大麻素的动力学。报告还首次研究了 9-TH
15、C、CBD 和 CBG 三种酸前体的脱羧动力学。UHPSFC 已被证明是目前研究的九种大麻素的一种极好的分离和定量技术。在同一个实验中可以检测到酸和中性物，而无需事先脱羧或衍生。UHPSFC 允许在一定温度和时间范围内定量测定酸及其脱羧产物的浓度。Wang，M 14开发了一种使用 UHPSFC/PDA-MS 分析 30 种大麻植物提取物和制剂的新方法，九种最丰富的大麻素，即对 CBD、8-THC、THCV、9-THC、大麻酚（CBN）、CBG、THCA-A、CBDA 和CBGA 进行了定量测定（RSD 6.9%），与 GC 方法不同，在 UHPSFC 分析之前不需要衍生化或脱羧。与 UHPLC
16、 相比，大麻素的 UHPSFC 色谱分离显示出相反的洗脱顺序。结合 PDA-MS，这种正交性对于区分复杂基质中的大麻素很有价值。对所开发的方法进行了验证，并将定量结果与标准 UHPLC 方法进行了比较，这两种方法的 RSD 均在 13.0%以内。Riccardo Deidda 15采用 UHPSFC 和 UHPLC 两种色谱方法分析大麻素，UHPSFC 定量结果与 UHPLC 结果一致，证明了 UHPSFC 适用大麻素的分析。2.4 黄酮类黄酮类化合物分布广泛，具有心血管系统活性、抗菌抗病毒、抗肿瘤活性、抗氧化自由基活性、保肝活性等多种生物活性。Huang，Y 16建立了 SFC 法对 12 种黄酮类化合物在 ZORBAX RX-SIL 柱上使用梯度洗脱，18min 内实现基线分离，是 HPLC 法分离速度的 3 倍，并测定了滁菊、贡菊、杭菊以及毫菊中 5 种不同的黄酮类化合物（山奈酚、木犀草素、槲皮素、木樨草甘、蒙草苷）的含量，方法学验证表明该方法重复性好、灵敏度高。Jiang，ZM 17建立 SFC-DAD 法对 6 种黄酮类化合物在 10 min 内实现基线分离，SFC 法具有高
