1、海南医学2023年4月第34卷第8期Hainan Med J,Apr.2023,Vol.34,No.8NPM1促进骨肉瘤细胞迁移、增殖、侵袭的体外研究刘丰平，皮闻森，肖运祥，赵红卫三峡大学第一临床医学院脊柱外科，湖北宜昌443000【摘要】目的探讨核仁磷酸蛋白1(NPM1)对骨肉瘤细胞(143B及U2细胞)恶性表型迁移、增殖和侵袭能力的影响。方法采用Oncomine数据库查询NPM1在骨肉瘤中的表达水平；构建重组慢病毒载体，制成过表达NPM1慢病毒(Lv/ShNPM1)、阴性对照慢病毒(Lv/negative)和沉默NPM1慢病毒(Lv/ShNPM1)。分别转染人源骨肉瘤细胞系(143B及U2
2、细胞)，分为Lv/NPM1组、Lv/ShNPM1组、NC(Lv/negative)组。运用 Western blot法检测各组别中NPM1蛋白的表达水平。分别运用CCK8法、Wound healing法、Transwell invasion法检测各组细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力。结果Oncomine数据库查询结果显示，NPM1在骨肉瘤中呈高表达水平；检测各组中NPM1蛋白表达的结果显示：与NC组比较，Lv/ShNPM1组中NPM1蛋白表达水平降低，差异具有统计学意义(P0.05)；U2-OS 细胞中NC组、Lv/NPM1组和Lv/ShNPM1组细胞迁移率分别为(49.73.3)%、(64
3、.17.4)%、(24.36.6)%，143B细胞分别为(63.54.3)%、(753.7)%、(30.15.9)%，两种细胞Lv/ShNPM1组迁移率明显低于NC组，差异均有统计学意义(P0.05)；U2-OS细胞中NC、Lv/NPM1组、Lv/ShNPM1组侵袭细胞数分别为9826.3、16441、3814.6，143B 细胞分别为10419.1、19132.4、4127.6，两种细胞Lv/ShNPM1组侵袭细胞数明显少于NC组，差异均有统计学意义(P0.05)；CCK8实验结果显示143B和U2-OS细胞Lv/ShNPM1组增殖能力明显低于NC组，差异均有统计学意义(P0.05)。结论N
4、PM1能够体外增强骨肉瘤细胞迁移、增殖和侵袭能力。【关键词】骨肉瘤；核仁磷酸蛋白1；迁移；侵袭；增殖【中图分类号】R738【文献标识码】A【文章编号】10036350（2023）08107204NPM1 promotes the migration,proliferation,and invasion of osteosarcoma cells in vitro.LIU Feng-ping,PIWen-sen,XIAO Yun-xiang,ZHAO Hong-wei.Department of Spinal Surgery,the First Clinical Medical College
5、of ThreeGorges University,Yichang 443000,Hubei,CHINA【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of nucleophosmin 1(NPM1)on the migration,proliferation,and invasion of osteosarcoma cells(143B and U2-OS cells).MethodsBioinformatic prediction was performed to in-vestigate the expression level of NPM1
6、in osteosarcoma using Oncomine database.Recombinant lentivirus vector wasconstructed to prepare overexpressed NPM1 lentivirus(Lv/ShNPM1),negative control lentivirus(Lv/negative),and si-lent NPM1 lentivirus(Lv/ShNPM1),which were transfected into osteosarcoma cells(143B and U2-OS cells),respec-tively,
7、as Lv/NPM1 group,Lv/ShNPM1 group,NC(Lv/negative)group.Western blot was used to detect the expressionlevel of NPM1 protein in each group.CCK8 method,Wound healing method,and Transwell invasion method were usedto detect the proliferation,migration,and invasion ability of cells in each group.ResultsBio
8、informatic predictionshowed that NPM1 protein was over-expressed in osteosarcoma cells.Western blot results revealed that the expressionlevels of NPM1 protein was significantly lower in Lv/ShNPM1 group than NC(Lv/negative)group.In U2-OS cells,thecell migration rates in NC(Lv/negative)group,Lv/NPM1 g
9、roup,and Lv/ShNPM1 group were(49.73.3)%,(64.17.4)%,and(24.36.6)%,respectively;in 143B cells,the cell migration rates were(63.54.3)%,(753.7)%,and(30.15.9)%,respectively;the cell migration rates in Lv/ShNPM1 group were significantly lower than those in NC(Lv/nega-tive)group(P0.05).In U2-OS cells,the n
10、umber of invasive cells in NC(Lv/negative),Lv/NPM1,and Lv/ShNPM1groups were 9826.3,16441,and 3814.6,respectively;in 143B cells,the number of invasive cells were 10419.1,19132.4,and 4127.6,respectively;the number of invasive cells in Lv/ShNPM1 group were significantly lower than those inNC(Lv/negativ
11、e)group(P0.05).CCK8 experiment results showed that the proliferation ability of 143B and U2-OS cellsin Lv/ShNPM1 group was significantly lower than that in NC(Lv/negative)group(P0.05).ConclusionNPM1 pro-motes the migration,proliferation,and invasion of osteosarcoma cells in vitro.【Key words】Osteosar
12、coma;Nucleophosmin 1(NPM1);Migration;Invasion;Proliferation 论著 doi:10.3969/j.issn.1003-6350.2023.08.002基金项目：2020年湖北省宜昌市医疗卫生研究项目资助项目(编号：A20-2-007)。第一作者：刘丰平(1977)，男，副主任医师，研究方向为骨外科临床及基础。通讯作者：皮闻森(1992)，男，研究方向为骨肿瘤转移及其机制，E-mail：。骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是最常见的骨与软组织原发性恶性肿瘤，多发生于儿童和青少年。目前，手术治疗、放疗和大剂量化疗是骨肉瘤的主要治疗方法。
13、虽然近年来新辅助化疗药物使得患者生存率有所提高，但是几十年来五年生存率未见提仍未超过60%。其中，OS患者的死亡原因主要是肺部转移，一旦发生5年生存率低于20%1。因此，为了提高患者生存率，更需进一步阐明OS转移的分子机制，明确OS1072Hainan Med J,Apr.2023,Vol.34,No.8海南医学2023年4月第34卷第8期转移防治的有效的策略及靶点。当前诸多研究已经证实NPM1与肿瘤发生、发展及转移密切相关，是一种在多种恶性肿瘤中高表达的癌基因。本研究采用人源骨肉瘤细胞系(143B、U2-OS细胞株)，探讨沉默和过表达NPM1对骨肉瘤细胞恶性表型迁移、增殖和侵袭能力的影响。1
14、材料与方法1.1材料人源骨肉瘤细胞系143B和人源骨肉瘤细胞系U2-OS细胞株购自中国科学院细胞库(上海)，NPM1过表达、沉默及阴性对照慢病毒均购于上海吉凯基因。侵袭试验小室购于北京萌状科技公司。凝 胶制备 试剂 盒(AR018)购 于 Boster 公 司。DMEM培养液、胎牛血清购于美国Gibco公司。蛋白提取试剂盒(BB-3101)购于BestBio公司。NPM1单克隆抗体(兔抗人)购于美国ABcam公司(美国)。HRP标记山羊抗鼠多克隆抗体、-actin 单克隆抗体(鼠抗人)和HRP标记山羊抗兔多克隆抗体均购于中杉金桥公司(北京)。1.2实验方法1.2.1生物信息学预测于Oncomi
15、ne数据库进行检索，设置类别为骨肉瘤，得到NPM1在骨肉瘤中的表 达 水 平 情 况(https:/ blot 实验检测蛋白表达转染细胞72 h后消化、收集上述各组细胞，提取细胞蛋白，经BCA蛋白定量法测定蛋白含量。SDS-PAGE分离蛋白，于冰上湿转，依照Western blotting 实验手册操作，其中抗兔 NPM1 单克隆抗体比例为 12 000；抗鼠-actin 抗体比例为12 000；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠及山羊抗兔IgG比例为 15 000。洗膜后，加入ECL显色液，暗室内曝光。1.2.4CCK-8法检测细胞增殖能力将转染72 h后的U2-OS和143B细胞(3 000/
16、孔)用于试验操作，96孔培养板培养，时间为0 h、24 h和48 h。依照CCK-8法操作手册，每份实验平行做6次。1.2.5Wound healing法检测细胞迁移能力转染72 h后各组细胞，用于试验操作，胰蛋白酶消化后接种于6孔培养板内(细胞密度为5105/mL，500 L/孔，每种细胞5孔)。依照Wound healing法操作手册，每份实验平行做6次。试验结果采用Image J 1.47H软件分析。1.2.6Transwell invasion法检测细胞侵袭能力转染 72 h 后，胰蛋白酶消化各组细胞，用无血清培养基重悬，接种于 Transwell 侵袭小室内(细胞密度为1105个/mL，150 L/室)，依照Transwell invasion法操作手册进行操作。试验结果采用Image J 1.47H软件分析1.3统计学方法应用SPSS13.0 统计软件分析数据，统计作图软件为Raphpad6.0，计量数据以均数标准差(x-s)表示，两组比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1生物信息学结果于Oncomine数据库进行
