1、研究报告2023 年第49 卷第5 期(总第473 期)67DOI:10 13995/j cnki 11 1802/ts 032870引用格式:马浩博，游泽锐，廖晓慧，等 补料分批发酵法对细菌纤维素产量、结构及流变学特性的影响J 食品与发酵工业，2023，49(5):67 73 MA Haobo，YOU Zerui，LIAO Xiaohui，et al Effects of fed batch fermentation on yield，structure，andrheological properties of bacterial cellulose J Food and Fermentat
2、ion Industries，2023，49(5):67 73补料分批发酵法对细菌纤维素产量、结构及流变学特性的影响马浩博1，游泽锐1，廖晓慧1，侯诗雯1，陈小露1，李思漫1，廖秋冬1，2，3，李琳1，2，3，陈思谦1，2，3*1(东莞理工学院 化学工程与能源技术学院，广东 东莞，523808)2(东莞理工科技创新研究院，广东 东莞，523808)3(东莞理工学院 中国轻工业健康食品开发与营养调控重点实验室，广东 东莞，523808)摘要补料分批发酵法是工业上常用的连续发酵生产手段。其中，引入新批次的液态培养基的过程可能会对细菌纤维素(bacterial cellulose，BC)凝胶的产量和
3、品质造成影响。该研究探讨了2 株木糖驹形氏杆菌ATCC 53582 和ATCC 700178 在补料分批发酵过程中菌体数目、培养基碳源及氮源浓度的变化，并对补料分批法生产的细菌纤维素的产量、微观结构及流变学特性进行了研究。结果表明，在发酵第 7 天，ATCC 53582 的 BC 产量约是 ATCC700178 的12 倍。通过3 次分批补充碳源、氮源和种子液，菌株 ATCC 700178 的 BC 产量最高，增长了 5 9 倍，但 3次补料残留了约8 9 g/L 的碳源。BC 凝胶表现出强弹性特性，拥有纳米级纤维网络结构。菌株 ATCC 700178 分批补料生产的 BC 凝胶强度随补料次数
4、增加而增强。该研究对连续生产品质稳定的细菌纤维素凝胶提供了理论支撑。关键词补料分批发酵;细菌纤维素;木糖驹形氏杆菌;流变学;碳源第一作者:本科生(陈思谦讲师为通信作者，E-mail:chensq dgut edu cn)基金项目:广东省科技创新战略专项资金项目(pdjh2021b0494);国家自然科学基金青年科学基金项目(31801544);东莞理工学院科技创新研究院平台建设项目(KCYCXPT2017007)收稿日期:2022-07-04，改回日期:2022-08-10细菌纤维素(bacterial cellulose，BC)是一种主要由驹形氏杆菌属(Komagataeibacter)细菌
5、(旧称葡糖醋杆菌属或木醋杆菌属)生产的胞外多糖1。在食品工业中，BC 常被应用于椰果、增稠剂、食品包装等相关产品2。BC 具有与植物纤维素相同的化学组成，都是由-1，4-糖苷键连接的大量葡萄糖基单元形成的高分子聚合物3。与主要来源于细胞壁的植物纤维素相比，BC 不含半纤维素、木质素等其他多糖杂质，具有较高的纯净度和结晶度。高度结晶的纤维素微纤丝在氢键作用下形成纳米级别的纤维束，相互缠绕形成多孔状纤维网络结构4。这种结构给 BC 提供了良好的持水性和黏弹性，赋予了椰果类食品产品多汁的特点和优良的咀嚼性5。BONILLA 等6 利用流变学测试方法分析了 BC 凝胶的模量特性，发现凝胶的弹性模量主要
6、由纤维网络密度决定。也有研究发现，菌种和发酵条件等因素都会对纤维素凝胶流变特性产生较大影响，最终影响产品品质7。木糖驹形氏杆菌生产 BC 为好氧发酵过程，通常使用表面静置发酵法进行生产8。补料分批发酵法是发酵工业中常用的补充发酵底物及菌种、分批获取发酵产品的方法，适用于连续生产并提高产品转化率9。对于以表面静置发酵法生产 BC，补料时加入液态培养基、搅动等过程可能会给发酵液施加一定剪切力，影响 BC 的产量、微观结构、流变学特性等，进而影响产品品质10。本研究利用表面静置发酵法，对比了分批补料(碳源、氮源、种子液)发酵法对木糖驹形氏杆菌菌株 ATCC 53582 和 ATCC 700178 生
7、产BC 的影响。重点讨论了木糖驹形氏杆菌在发酵过程中的碳源、氮源和菌体数目的变化，及分批补充碳源、氮源和种子液对 BC 凝胶产量、微观结构及流变学特性的影响。以期为提高 BC 产量及保证产品品质的稳定性提供借鉴。1材料与方法1 1材料与试剂1 1 1菌株及培养基木糖驹形氏菌(Komagataeibacter xylinus)ATCC53582 和 ATCC 700178，美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection，ATCC)。文中均以保藏编号表示。培养基(g/L):葡萄糖 20、Na2HPO42 7、一水合柠檬酸 1 26、酵母提取物 5、蛋白胨 5
8、、去离子水。使用 1 mol/L 盐酸调节 pH 至 5 0，115 高压灭菌25 min 冷却至室温后使用。食品与发酵工业FOOD AND FEMENTATION INDUSTIES682023 Vol.49 No.5(Total 473)1 1 2实验试剂酵母提取物、蛋白胨，赛默飞世尔科技公司;琼脂粉，广 东 环 凯 微 生 物 科 技 有 限 公 司;葡 萄 糖、Na2HPO4、一水合柠檬酸、浓盐酸、NaOH、山梨酸钾(均为分析纯)，天津市大茂化学试剂厂;去离子水，实验室制备。1 2仪器与设备ME104E 万分之一分析天平，梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司;Smart-Q15 去离
9、子纯水机，上海和泰仪器有限公司;PHS-3C 雷磁 pH 计，上海仪电科学仪器股份有限公司;YM50 立式压力蒸汽灭菌器，上海三申医疗器械有限公司;SW-CJ-1FD 洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司;DNP-9162 电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司;MC702 流变仪，奥地利安东帕公司;ME104E 液氮罐，成都查特低温设备有限公司;Scientz-10 ND 冷冻干燥机，宁波新芝冻干设备股份有限公司;MiniFlex 600 台式 X 射线衍射仪，日本理学公司;Spark 96 孔板酶标仪，瑞士Tecan 公司;ETD-2000 离子溅射仪，北京博远微纳科技有限公司;EM-3
10、0 PLUS 台式扫描电镜，韩国库赛姆公司。1 3实验方法1 3 1BC 的培养条件和菌体光密度测定木糖 驹 形 氏 菌 菌 株(Komagataeibacter)ATCC53582 和 ATCC 700178 以 10%(体积分数)的接种量接种于总体积为 20 mL 的培养基中。使用直径为40 mm 的圆柱形无菌塑料杯为发酵容器，以 7 d 为一个周期，在30 下静置培养4 个周期，共28 d。为了比较 2 株菌在发酵过程中的单位菌体葡萄糖消耗和纤维素产量的关系，测定发酵过程 1 个周期内(7 d)每天的菌体数以 OD 值表示。1 3 2BC 的培养条件和菌体光密度测定发酵开始后的第 1、2
11、、3、4 个周期结束时(第 7、14、21、28 天)，分别取 0 1 mL 木糖驹形氏菌培养液于离心管中，4 000 r/min 离心 10 min，获得上清液。取50 L 上清液于试管中，加入950 L 去离子水稀释，获得样品。将蒸馏水、标准品、样品与工作液加入 96 孔板酶标仪中。将酶标仪升温至 37，设定振荡孔板时间为 5 s，37 孵育 10 min。在 505 nm波长下测定各孔吸光值。将吸光值代入葡萄糖标准曲线得出残留碳源浓度，并计算第 1 3 周期结束时需要的碳源补料量(补充至原培养基碳源浓度的所需量)。1 3 3发酵过程培养基残留氮源测定使用考马斯亮蓝法测定。将上述获得的1
12、mL 上清液与1 mL 去离子水混合，加入5 mL 的考马斯亮蓝染色液，混匀后室温静置 3 min。以空白溶液作为对照，于 595 nm 处测定吸光值。将测得的吸光度值代入蛋白质标准曲线得出残留氮源浓度，并计算第 1 3 周期结束时需要的氮源补料量(补充至原培养基氮源浓度的所需量)。1 3 4发酵过程中的分批补料将培养的木糖驹形氏菌样品根据补料次数(0 4 次)分别分成 4 组。为了探究收获样品后残留碳源和氮源是否能继续使木糖驹形氏菌合成BC，每组样品统一保持发酵 4 个周期(28 d)。具体的补料次数、残留碳氮源测定时间和 BC 样品收获时间详见表 1。补料方法为在移除气液界面已有BC 凝胶
13、后，使用移液枪，将枪头贴紧发酵容器内壁缓慢将补充培养基加入，以尽量减少新引入培养基产生的剪切力。表 1分批补料设计及残留碳源氮源测定时间Table 1The design of fed batch fermentation and measurement time of residual carbon and nitrogen source发酵时间A 组B 组C 组D 组1 个周期(第 7 天)收获 BC;测定残余碳源、氮源含量补充碳源、氮源及种子液分别至20 g/L、10 g/L 和 10%(质量分数)补充碳源、氮源及种子液分别至20 g/L、10 g/L 和 10%(质量分数)补充碳源、氮
14、源及种子液分别至20 g/L、10 g/L 和 10%(质量分数)2 个周期(第 14 天)/收获 BC;测定残余碳源、氮源含量补充碳源、氮源及种子液分别至20 g/L、10 g/L 和 10%(质量分数)补充碳源、氮源及种子液分别至20 g/L、10 g/L 和 10%(质量分数)3 个周期(第 21 天)/收获 BC;测定残余碳源、氮源含量补充碳源、氮源及种子液分别至20 g/L、10 g/L 和 10%(质量分数)4 个周期(第 28 天)计算总 BC 产量计算总 BC 产量计算总 BC 产量收获 BC;计算总 BC 产量;测定残余碳源、氮源含量研究报告2023 年第49 卷第5 期(总
15、第473 期)691 3 5BC 的浓度和产率测定将收获的 BC 凝胶使用去离子水在120 r/min 的搅拌条件下水洗 3 5 次，直至凝胶从黄棕色变成浅白色。使 用 浓 度 为 0 1 mol/L 的 NaOH 溶 液 于100 煮沸 30 min 以除去残余的培养基和菌体。将收获的 BC 膜置于烘箱中 105 烘干至恒重，称量记录干重，定义为产量。进行 3 次平行实验，取算术平均值和标准差。1 3 6BC 的流变学性能测定使用旋转流变仪在 25 下，通过振荡模式(动态模式)测量 BC 凝胶的流变性能。使用40 mm 不锈钢平行板，平板间距设置为与 BC 凝胶高度一致(根据样品不同，范围在
16、1 4 mm)。振幅扫描测试:通过设定角频率为 1 rad/s，剪切应变振幅扫描范围为0.001 10。以安东帕 heoCompass 1 2 3 分析数据以确定小振幅振荡剪切中线性黏弹区的振幅值。频率扫 描 测 试:将 角 频 率 变 化 范 围 设 定 为 0.1 100 rad/s，应变振幅设定为 0 1(软件推荐的振幅值)以进行频率扫描实验，记录弹性模量(G)和黏性模量(G)的值。每次试验进行 3 次平行测定并取算术平均值。1 3 7发酵过程中的分批补料BC 微观形貌结构使用扫描电子显微镜观察。将收获 的 BC 凝 胶 使 用 液 氮 迅 速 冻 结，然 后 放 入50 的冷冻干燥机中冻干至恒重。将干燥好的BC 凝胶从冷冻干燥机中取出后，使用小刀以垂直方向将其切成约为 3 mm 3 mm 的小块，放于离子溅射仪中喷金处理 1 min。观测电压设置为 15 kV，对于BC 从不少于 3 个不同的随机位置进行观察，放大倍数设定为 10 000 倍。2结果与分析2 1木糖驹形氏菌 ATCC 53582 和 ATCC 700178的菌体数目和产量关系由图 1-a 可见，在 1 个发酵周
