1、收稿时间 2022-02-14；修回日期 2022-05-24基金项目上海市自然科学基金(22ZR1437000)作者简介陈宛灵（1995-），女，硕士研究生，E-mail:通信作者田臻，E-mail：tian0304_；顾挺，E-mail：。#共同通信作者c2023年版权归上海口腔医学编辑部所有穿刺小标本改良石蜡块制作方法及评价陈宛灵，石超吉，王敏，顾挺#，田臻#（上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔病理科，上海交通大学口腔医学院，国家口腔医学中心，国家口腔疾病临床医学研究中心，上海市口腔医学重点实验室，上海市口腔医学研究所，上海200011）摘要目的：改良现有琼脂预包埋石蜡包埋法，评价该
2、包埋法对空芯针穿刺活检小标本组织完整性、组织学形态、蛋白质和DNA检测的影响。方法：取10例口腔黏膜鳞癌空芯针穿刺活检标本，分别进行成型包埋模具的改良琼脂预包埋石蜡包埋法及常规石蜡包埋法，前者缩短脱水时间至3.5 h，后者为12 h。样本处理后，分别行H-E染色、组织学形态、免疫组织化学（IHC）和DNA荧光原位杂交（FISH）等检测，并对检测结果进行对比分析。采用GraphPad Prism 9软件包对数据进行组间t检验。结果：改良琼脂预包埋法较琼脂预包埋法降低了操作难度，易于推广。与常规石蜡包埋法相比，组织脱水时间显著缩短（P0.001），对镜下组织学形态及后续IHC和FISH检测无影响。
3、结论：改良琼脂预包埋石蜡包埋法满足临床病理诊断对组织处理的要求，是值得推广的空芯针穿刺活检标本组织包埋法。关键词空芯针穿刺活检；琼脂预包埋；石蜡包埋中图分类号 R780.2文献标志码 ADOI:10.19439/j.sjos.2023.01.002An improved paraffin embedding method for small core needle biopsy:technical introduction and evaluationCHEN Wan-ling,SHI Chao-ji,WANG Min,GU Ting,TIAN Zhen.(Department of Oral
4、 Pathology,Shanghai Ninth Peo-ples Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine;College of Stomatology,Shanghai Jiao Tong University;National Center for Stomatology;National Clinical Research Center for Oral Diseases;Shanghai Key Laboratory of Stoma-tology;Shanghai Research Institute of
5、 Stomatology.Shanghai 200011,China)Abstract PURPOSE:Modified agar pre-embedded paraffin embedding method was proposed to evaluate the effects ontissue integrity,histological morphology,protein and DNA detection in small specimens of core needle biopsies.METHODS:The core needle biopsy specimens of 10
6、 patients with oral mucosal squamous cell carcinoma were subjected to modifiedagar pre-embedded paraffin embedding using molded embedding molds and conventional paraffin embedding respectively,the dehydration time of the former was 3.5 h and that of the latter was 12 h.After tissue treatment,H-E sta
7、ining,histo-logical morphology,immunohistochemistry(IHC),and DNA fluorescence in situ hybridization(FISH)were performed,re-spectively.The results were compared and analyzed using GraphPad Prism 9 software package.RESULTS:The modifiedagar pre-embedding method was less difficult to perform than the ag
8、ar pre-embedding method,and easier to be promoted.Compared with conventional paraffin embedding method,the tissue dehydration time was significantly reduced(P0.001),and the results of microscopic histological morphology and subsequent IHC and FISH assays were reliable.CONCLU-SIONS:The modified agar
9、pre-embedded paraffin embedding method meets the requirements of clinical pathological di-agnosis for tissue processing,and is worthy of clinical application for core needle biopsy specimens.Key words Core needle biopsy;Agar pre-embedded;Paraffin embeddingShanghai J Stomatol,2023,32(1):6-11.病理活检（bio
10、psy）是肿瘤诊断的金标准，在预后评估、治疗方案制定中的作用举足轻重1。随着医学进步，空芯针穿刺活检（core needle biopsy）因创伤小、敏感度和特异度高等优势，在口腔颌面部疾病（特别是深部肿瘤）的诊断方面应用越来越广泛2。多项研究3-5表明，空芯针穿刺活检（或在影像指导下的空芯针穿刺活检）对区分良、恶性肿瘤，判断肿瘤类型等具有较高的价值，是一种创伤小、安全的术前诊断方式。在活检技术向微创发展的同时，病理诊上海口腔医学2023年2月 第32卷第1期Shanghai Journal of Stomatology Vol32 No1 February,20236断技术也从传统走向现代，
11、免疫组织化学（immuno-histochemistry，IHC）和分子病理技术日渐成熟并陆续用于临床，成为保证病理诊断准确性的必要技术。通常，穿刺活检标本一般直径小于2 mm，属小或微小体积标本。若为恶性肿瘤，则往往标本质脆、易碎，最大限度保存原有组织形态、减少组织处理过程中组织量丢失以满足镜下诊断以及IHC、分子检测需要，对脱水、透明、包埋等组织处理过程提出了更高要求。目前临床上对于这些小/微小标本仍多采用最常用的普通石蜡包埋法（paraffin embedded method）6，常存在组织经脱水、包埋等处理后标本量减少等问题，不利于微/小标本的镜下诊断。琼脂预包埋法（agarpre-e
12、mbedding）最早是电镜标本制作中常使用的一种包埋方法，后被用于体外培养细胞和不易成团细胞的组织包埋，也有用于小血管光镜制片7、分离提纯后细胞器和病毒颗粒等电镜标本8制作的报道。该包埋方法主要采用琼脂包裹细碎组织，再按常规脱水、包埋程序制成石蜡包埋标本，即琼脂预包埋结合石蜡包埋法，可避免或减少标本破损及组织损失，但此方法存在操作步骤增多、烦琐、组织处理时间长和病理报告时间延长等缺点，一直无法在临床上推广应用。近年来有文献9报道，基质胶包裹的类器官（organoid）采用短时间脱水，仍能保存较好的组织学形态，而琼脂的物理性状与基质胶类似，基于此，本研究对琼脂预包埋石蜡包埋法进行改良，以简化琼
13、脂预包埋操作方法及缩短脱水时间，用于空芯针穿刺活检标本处理，与常规石蜡包埋法进行比较，旨在评价空芯针穿刺样本的改良琼脂预包埋石蜡包埋法的临床应用价值。1材料与方法1.1样本选择上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔病理科10例口腔黏膜鳞癌患者术后标本，使用空芯针穿刺取得组织样本，每例标本共穿刺4条组织，分2组，每组2条组织，分别采用改良琼脂预包埋石蜡包埋法和常规石蜡包埋法进行处理。1.2实验方法1.2.1琼脂配制取适量蒸馏水，放入烧杯中，于烧杯中加入琼脂粉（北京奥博星生物公司），将烧杯置于电磁炉锅上，不断加热搅拌至沸腾，配制成5%琼脂溶液。5 min后，加入果绿染剂溶液（上海染料研究所有限公司
14、），搅拌；10 min后，用吸管吸出所有琼脂并分装至15 mL离心管中，置于-20 冰箱内备用。1.2.2琼脂预包埋组织经4%甲醛室温固定，夹出后置于一次性塑料包埋模具（图1，标注为A，江苏世泰实验器材有限公司）中。提前预热琼脂溶液，以吸管吸取适量，缓慢从模具四周倒入模具中，直至琼脂溶液完全包裹组织。室温下凝固琼脂溶液，琼脂包埋块依次浸入70%乙醇30 min，85%乙醇30 min，95%乙醇30 min，100%乙醇2 h进行脱水，脱水总时长为3.5 h。脱模，二甲苯透明、浸蜡、组织石蜡包埋（图1）。1.2.3常规石蜡包埋为最大限度减少组织损失，常规石蜡包埋中通常将标本包裹于薄滤纸中，再放
15、入包埋盒，梯度乙醇脱水：75%乙醇2 h，85%乙醇2 h，95%乙醇2 h 2次，100%乙醇2 h 2次，脱水总时长12 h。二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋。1.2.4苏木精-伊红（H-E）染色取上述2种方法包埋后的组织标本，切成4 m白片，常规H-E染色，中性树胶封片，镜检。1.2.5免疫组织化学染色采用EnVisonTM（DAKO，上海启中信息技术有限公司）二步法。取上述2种方法包埋后的组织标本，切成3 m白片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，pH 8.0 EDTA缓冲液抗原修复20 min；孵育一抗：CK5/6（1200）、CKH（1200）、CD31（1200）、Ki67（1200）、P16
16、（1200）、P53（1200）、S100（1100）（迈新生物技术开发有限公司），EGFR（1100）（澳泉医疗科技有限公司），4 过夜；孵育二抗30 min，DAB显色，苏木精衬染，中性树胶封片。由2图1改良琼脂预包埋石蜡包埋法流程图。A.塑料包埋模具；B.琼脂包埋的组织块Figure 1 Flow chart of the modified agar pre-embedded paraffinembedding method.A.Plastic embedding mold;B.Agar-embed-ded tissue block固定预包埋脱模透明、浸蜡石蜡包埋组织活检陈宛灵，等.穿刺小标本改良石蜡块制作方法及评价CHEN Wan-ling,et al.An improved paraffin embedding method for smallcore needle biopsy:technical introduction and evaluation7名病理科医师独立阅片评价，CK5/6、CKH以细胞质棕褐色染色为阳性，EGFR、CD31以细胞膜棕褐色染色为阳性，S100
