1、引用:周文，陆杉，蒋满波，郑细闰，谢妍，袁启龙，周欢群.补肾活血方对精索静脉曲张大鼠生精功能的影响 J.湖南中医杂志，2023，39(4):184189.补肾活血方对精索静脉曲张大鼠生精功能的影响周文，陆杉，蒋满波，郑细闰，谢妍，袁启龙，周欢群(广东省中医院生殖医学科，广东广州，510006)摘要 目的:基于细胞周期调控因子细胞周期蛋白 D1(cyclin D1)、细胞周期蛋白依赖激酶 4(cdk4)的表达探讨补肾活血方改善精索静脉曲张大鼠生精功能的机制。方法:将 30 只大鼠随机均分为假手术组，模型组，补肾活血方低、中、高剂量组，每组各 6 只。建立左侧精索静脉曲张模型，造模成功后补肾活血方
2、低、中、高剂量组分别灌胃补肾活血方药液 6、12、24 g/kgd1，其余 2 组灌胃 10 ml/kgd1的 0.9%氯化钠注射液，灌胃 30 d。检测精子浓度、活力、畸形率及 DNA 碎片率，HE 染色观察睾丸组织形态，免疫组化分析睾丸cyclin D1、cdk4 表达。结果:在大鼠浓度、精子活力、精子畸形率、精子 DNA 碎片率、睾丸病理评分及 cyclinD1、cdk4 表达方面模型组与假手术组比较，补肾活血方低、中、高剂量组与模型组比较，差异均有统计学意义(P0.05 或 P0.01);补肾活血方低、中、高剂量组精子浓度、活力、畸形率、DNA 碎片率组间比较，差异均无统计学意义(P0
3、.05)。结论:补肾活血方可能通过调控 cyclin D1、cdk4 表达来改善精索静脉曲张大鼠的精子发生。关键词 精索静脉曲张;补肾活血方;cyclin D1;cdk4 中图分类号 2855 文献标识码 ADOI:1016808/jcnkiissn10037705202304040基金项目:广东省中医药局科研项目(20201146)第一作者:周文，男，主管技师，研究方向:中医药治疗男性不育症通信作者:周欢群，女，主管技师，研究方向:中医药治疗男性不育症，Email:zhouhuanqun8686 163comEffect of kidneytonifying and bloodactivat
4、ing prescription onspermatogenic function in rats with varicoceleZHOU Wen，LU Shan，JIANG Manbo，ZHENG Xirun，XIE Yan，YUAN Qilong，ZHOU Huanqun(Department of eproductive Medicine，Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510006，Guangdong，China)Abstract Objective:To investiga
5、te the mechanism of kidneytonifying and bloodactivating prescriptionimproving the spermatogenic function of rats with varicocele based on the expression of the cell cycle regulatorscyclin D1 and cyclindependent kinase 4(cdk4).Methods:A total of 30 rats were randomly divided into shamoperation group，
6、model group，and low，middle，highdose kidneytonifying and bloodactivating prescriptiongroups，with 6 rats in each group.A model of left varicocele was established;after successful modeling，the rats inthe low，middle，high dose groups were given the solution of kidney tonifying and blood activatingprescri
7、ption by gavage at a dose of 6，12，and 24 g/kgd1，respectively，and those in the shamoperation groupand the model group were given 0.9%sodium chloride injection by gavage at a dose of 10 ml/kgd1，for 30days.The rats were observed in terms of sperm concentration，sperm motility，rate of sperm deformation，a
8、nd spermDNA fragmentation rate;HE staining was used to observe the histomorphology of the testis，and immunohistochem-istry was used to measure the expression of cyclin D1 and cdk4 in the testis.esults:There were significant differ-ences in sperm concentration，sperm motility，rate of sperm deformation
9、，sperm DNA fragmentation rate，pathologi-481第 39 卷第 4 期2023 年 4 月HUNAN JOUNAL OF TADITIONAL CHINESE MEDICINEVol.39No.4Apr.2023cal score of the testis，and the expression of cyclin D1 and cdk4 between the model group and the shamoperationgroup，as well as between the low，middle，highdose groups and the m
10、odel group(P0.05 or P0.01).Therewere no significant differences in sperm concentration，sperm motility，rate of sperm deformation，and sperm DNAfragmentation rate between the low，middle，highdose groups(P0.05).Conclusion:Kidneytonifying andbloodactivating prescription can improve the spermatogenic funct
11、ion of rats with varicocele by regulating the ex-pression of cyclin D1 and cdk4.Keywords varicocele;kidneytonifying and bloodactivating prescription;cyclin D1;cyclindependentkinase 4精索静脉曲张(varicocele，VCL)是引起男性不育的首要原因1，它主要通过阻滞睾丸血液循环、抑制内分泌、加剧氧化应激及炎症反应等途径抑制精子发生及损害精子质量2。生殖之精的生成障碍、络脉瘀阻是导致不育的中医病机，其治疗应以补肾生
12、精为主、活血化瘀通络为辅3。本课题组前期研究显示，补肾活血方可明显改善 VCL 不育男性的精子质量，改善率优于迈之灵4。亦有研究显示，补肾活血方可改善 VCL 性精子异常47，但其具体机制仍不明确。细胞周期蛋白 D1(Cyclin D1)在部分精原细胞有丝分裂的 DNA 合成前期(G1)表达增加，它与细胞周期蛋白依赖激酶 4(cdk4)相互作用形成复合物，调控 G1 期向 DNA 复制期(S)的进展8。Amin M 等9 研究显示，VCL 可诱导睾丸细胞 DNA 损伤，上调 p21，抑制 cdk4/cyclin D1 形成，导致 G1/S 期阻滞，并抑制精子发生。目前补肾活血方能否通过改善 G
13、1/S 期阻滞来促进精子发生仍未见相关报道，故本文通过免疫组化分析周期调控因子 cyclin D1、cdk4 的表达，初步探讨补肾活血方改善 VCL 性生精阻滞的新机制。1实验材料1.1动物选取 SPF 级成年雄性 SD 大鼠 30 只，体质量 200220 g，购自广州南方医科大学实验动物中心。动物实验于广东省中医院科研楼完成，动物许可证号:SYXK(粤)20180094。1.2药物补肾活血方:菟丝子 15 g，枸杞子 15 g，锁阳 10 g，覆盆子 10 g，五味子 10 g，车前子 10 g，淫羊藿 10 g，当归 10 g，川芎 10 g，牡丹皮 10 g，炙甘草6 g。采用中药配方
14、颗粒(天江药业)，无菌 0.9%氯化钠注射液溶解，制成 2 gml1生药浓度，30储存备用。1.3主要试剂与仪器1)试剂。丫啶橙染色试剂盒(深圳博锐德)，精子细胞染色试剂盒(改良巴氏法，南京欣迪)，Sperm inse 精子培养液(美国SAGE)，免疫组化 cyclin D1、cdk4 抗体(美国 Bio-world)，HE 染色试剂盒(北京 Solarbio)等。2)主要仪器。流 式 细 胞 仪(BECKMAN COULTE Cyt-oFLEX)，相差显微镜(尼康 50i)，精子计数板(以色列 Makler)，病理切片机(Leica M2016)，全自动染色机(Leica ST5010)等。
15、2实验方法2.1模型制备参考 Saypol 法10，将 10%水合氯醛麻醉大鼠，取中线切口，分离左肾静脉注入下腔静脉的入口处，将左肾静脉分离一钝性通道，使用3/0 线将直径 0.6 mm 针头与左肾静脉共同结扎，再轻退针头，达到左肾静脉部分狭窄的目的。精索静脉是发自睾丸蔓状静脉丛，上行经腹股沟皮下环、腹股沟管、内环入腹腔，左精索静脉呈直角汇入左肾静脉，左肾静脉结扎导致左精索静脉回流不畅，发生左侧精索静脉曲张。左精索静脉术后 2 个月验证造模效果，左肾未萎缩，且左精索静脉直径达右侧 2 倍以上者，造模成功。2.2分组及给药将 30 只大鼠随机分为假手术组，模型组，补肾活血方低、中、高剂量组，每组
16、各6 只。假手术组只行肾静脉分离，不缩窄左肾静脉。补肾活血方低、中、高剂量组均建立左侧 VCL 模型，且分别灌胃 6、12、24 kgd1补肾活血方药液，其余2 组灌胃 10 ml/kgd10.9%氯化钠注射液，连续干预 30 d。2.3观察指标2.3.1精子浓度、活力、畸形率取左侧附睾尾，置于1ml 37预热的 Sperm inse 中，注射器针头刺破附睾尾，镊子轻轻挤压，可见白色絮状物溢出，置于 37、5%CO2培养箱中孵育 20 min，备用。采用Makler 计数板，200相差显微镜计数不少于 200 条精子，计算精子浓度和活力。制备精子涂片，采用改良巴氏法染色，1000油镜下计数精子 400 条以581第 4 期周文，陆杉，蒋满波，等:补肾活血方对精索静脉曲张大鼠生精功能的影响上。大鼠精子形态评估参考 Seed J 等11 的方法，计算精子畸形率。2.3.2精子 DNA 碎片率采用精子染色质结构分析法。参照丫啶橙染色试剂盒操作，Beckman Dxflex流式细胞仪上机检测 10000 个细胞。建立FSCA/SSCA 散点图，选择精子细胞群，建立 PC5.5/FITC荧光通道
