1、安徽农学通报2023年03期基因分子 生理生化 遗传育种 组织培养醇化烟叶附生产蛋白酶细菌分离筛选及活性评估梁伟1刘鸿1邹克兴1陈义昌1王小东2孙会忠2蔡联合1苏赞1胡逸超1（1广西中烟工业有限责任公司技术中心，广西南宁 530000；2河南科技大学农学院，河南洛阳 471023）摘要本文以醇化烟叶为材料，采用平板分离技术分离培养出 26 株细菌活体纯培养物，依次编号为GXZY1GXZY26，纯化菌株通过牛奶琼脂培养基的鉴别培养，初筛出GXZY3、GXZY7和GXZY9 3株具有明显的水解圈，初步定性为产蛋白酶功能细菌。对GXZY3、GXZY7和GXZY9菌株连续60 h的连续发酵实验，发现3
2、株菌发酵液中的蛋白酶活性均呈现先高后低的变化规律，酶活性的最大值均出现在发酵后18 h；GXZY9菌株发酵液中的酶活性持续保持高位，最大值达到18.2 U/g，且酶活性下降幅度最小，而GXZY3和GXZY7则在发酵36 h后持续下降到较低水平。对菌株GXZY13的多相鉴定结果表明，其隶属于芽孢杆菌属（Bacillus），命名为Bacillussubtilis GXZY9。菌株GXZY9对烤烟蛋白质含量具有较强的调控功能，可作为烟叶醇化微生物制剂开发的良好备用菌株。关键词烟叶醇化；附生菌；蛋白酶；筛选中图分类号S47文献标识码A文章编号1007-7731（2023）03-0021-05Isola
3、tion,Screening and Activity Evaluation of Protease ProducingBacteria from Alcoholized Tobacco LeavesLIANG Wei1LIU Hong1ZOU Kexing1CHEN Yichang1WANG Xiaodong2SUN Huizhong2CAI Lianhe1SU Zan1HU Yichao1（1Technical Center of Guangxi China Tobacco Industry Co.,Ltd.,Nanning Guangxi 530000;2College of Agric
4、ulture,Henan University of Science and Technology,Luoyang Henan 471023）AbstractTwenty-six strains of pure bacteria in vivo were isolated and cultured from alcoholized tobacco leaf byplate separation technology,which were numbered GXZY1-GXZY26.The purified strains were identified by milkAGAR medium a
5、nd GXZY3,GXZY7 and GXZY9 had obvious hydrolytic circles,and were preliminarily identified asprotease-producing functional bacteria.The protease activity of GXZY3,GXZY7 and GXZY9 strains in the fermentationbroth of GXZY3,GXZY7 and GXZY9 strains increased at first and then decreased,and the maximum va
6、lue of enzymeactivity occurred at 18 h after fermentation.The enzyme activity in the fermentation broth of GXZY9 strain remainedhigh,reaching the maximum value of 18.2 U/g,and the enzyme activity decreased the least,while the enzyme activity ofGXZY3 and GXZY7 continued to decrease to a low level aft
7、er 36 h of fermentation.Polyphase identification of strainGXZY13 showed that it belonged to Bacillus subtilis GXZY9.Strain GXZY9 had strong regulation function on proteincontent of flue-cured tobacco and could be used as a good standby strain for the development of tobacco mellowmicrobial preparatio
8、n.Keywordstobacco mellow;pick the fungus;protease;screening烟叶醇化是卷烟生产过程中的重要一环，与卷烟风格和特色形成关系密切，其核心原理是通过醇化可以消除烟叶天然存在的刺激性大、青杂气重、烟气粗糙、余味涩口、香气显露不足的品质缺陷1-3。大量研究证明2-5，烟叶醇化是一个极其复杂的过基金项目广西中烟工业有限责任公司科技计划项目（功能微生物提升真龙卷烟原料醇化质量技术研究，GXZYCX2021B002）。作者简介梁伟（1979），男，河南辉县人，硕士，高级农艺师，从事烟草原料应用研究工作。收稿日期2022-04-26-21DOI:10.1
9、6377/ki.issn1007-7731.2023.03.010安徽农学通报2023年03期基因分子 生理生化 遗传育种 组织培养程，醇化风格和特色的形成受多种因素的影响，醇化过程中烟叶化学成分和其他物理化学特征的分化和定型，对微生物及其产生的酶发挥了极其关键的作用，主要是因为微生物不仅可以通过自身的生命活动作用于烟叶醇化过程，还可通过其代谢产生的生物酶参与烟叶的生理生化反应，促进烟叶中生物大分子的转化，同时微生物因素对烤烟醇化周期也有深刻影响。影响烤烟醇化的微生物酶也是一个复杂的体系，多酚氧化酶（polyphenol oxidase）、蛋白酶（protease）、淀粉酶（amylase）、
10、蔗糖酶（sucrase）、纤维素酶（cellulase）等均参与其中6-8。蛋白质含量过高的烟叶在燃烧吸食时会有较为强烈的烧焦羽毛臭味，而且烟叶的燃烧性也相应变差，故蛋白质含量是烟叶品质和吸食者健康评价的重要影响因素，因而蛋白质含量调控就成了烟叶醇化工艺和技术的重要组成部分，微生物降解蛋白质含量的机理是将大分子蛋白质降解为氨基酸等小分子物质，从而降低烟叶蛋白质含量，但不同的烟叶品种、存储条件和工艺类型，调控醇化烟叶蛋白质含量的功能微生物种类也存在差异。在此背景下，本文结合广西中烟工业有限责任公司卷烟生产过程中醇化周期偏长的实际现状，着眼特定卷烟生产原料，开展了醇化烟叶附生益生菌的分离、筛选、鉴
11、定和活性评估等研究工作，以期为烟叶醇化提供更加具有针对性的益生菌遗传资源。1材料与方法1.1材料烟叶样品于2022年2月取自广西中烟工业有限责任公司烟叶仓库，烟叶品种是K326。枯草芽孢杆菌标准株（Bacillus subtilis ATCC 6633）由河南科技大学农学院特色生物资源开发与利用试验室保藏。1.2培养基烟叶水浸提物固体分离培养基：20 g烟叶样品加入400 mL蒸馏水煮沸提取30 min，冷却后2层纱布过滤得烟叶沸水浸提液。以分别添加10%、30%和50%的水浸提液代替 LB培养基成分，制备烟叶浸提物培养基（30%烟叶水浸提液固体培养基成分及配制：300 mL烟叶水浸提液，70
12、0 mL蒸馏水，牛肉膏 0.3 g，蛋白胨 1.0 g，NaCl 0.5 g，琼脂 1.5 g，pH 自然，120 高压蒸汽灭菌30 min）。牛奶琼脂鉴别培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，脱脂奶粉15 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。发酵培养基：1 000 mL蒸馏水，葡萄糖20 g，醇化烟叶粉碎样品（37 烘干6 h，过40目筛）10 g。LB培养基：胰蛋白胨7g，酵母提取物3g，NaCl5g，琼脂 20 g，pH自然。1.3醇化烟叶附生细菌的分离纯化取醇化烟叶粉碎样品（过40目筛）5 g装入灭菌三角瓶，加入100 mL无菌水，震荡5 min，
13、静置5 min后，分别取50、100、150 L不同体积上清液涂布于固体分离培养基，每个体积涂6个平板，28 恒温培养48 h后，挑取菌落连续进行3次平板划线纯化，并将纯化菌株甘油-20 保存。1.4纯化菌株产蛋白酶活性初筛将纯化菌株接种于牛奶琼脂鉴别培养基，28 恒温培养48 h，具有透明圈者定性为具有产蛋白酶活性目标菌株。1.5纯化菌株产蛋白酶活性复筛首先将目标待测菌株进行活化培养（OD600控制在 0.81.2），以2%接种量接种于发酵培养基，28、180 r/min摇床连续培养60 h，期间每隔6 h取样1次，测定发酵液蛋白酶活力。设3次重复，以不接种作为对照。蛋白酶活力采用文献方法进
14、行9-10。1.6菌株的多相分类鉴定将测定菌株于LB培养基培养48 h，制样进行光镜和扫描电镜观察11。生理生化指标的测定方法参考文献12-13进行。测定菌株16S rDNA分析操作方法参考文献进行，采 用 MEGA7 的 Neighbor-Joining 法 构 建 进化树14-15。2结果与分析2.1醇化烟叶附生细菌分离结果醇化烟叶粉碎样品稀释涂布烟叶水浸提物固体分离培养基平板中，28 培养23 d后，平板上形成特征典型的菌落（图1）。挑取菌落进行3次划线-22纯化，共获得26株细菌活体纯培养物，依次编号为GXZY1GXZY26。15%甘油-20 保种备用。图1醇化烟叶附生细菌分离平板2.
15、2产蛋白酶活性菌株初筛分别将获得的31株纯化菌株点接于牛奶琼脂鉴别培养基平板，28 培养23 d。结果表明，共有3株菌形成了明显的水解圈，分别是GXZY3、GXZY7和GXZY9（图2），其中GXZY9的抑菌圈直径最大，达到 24 mm，初步将其定性为具有生防活性功能菌株。A为GXZY3；B为GXZY7；C为GXZY9图23株产蛋白酶菌株形成的水解圈2.3产蛋白酶活性菌株发酵液酶活性如图3所示，GXZY3、GXZY7和GXZY9 3株菌经过连续60 h的发酵，发酵液中的蛋白酶活性与对照相比存在显著变化，总体而言，3株菌均呈现先高后低的变化规律，酶活性的最大值均出现在发酵18 h时间节点；3株菌
16、相比较而言，GXZY9菌株发酵液中酶活性最大，为18.2 U/g，且酶活性下降幅度最小，酶活性维持高位的时间最长，GXZY3和GXZY7则在发酵36 h后持续下降。以上结果说明3株产蛋白菌株对蛋白质存在不同的调节能力，可作为后期烟叶醇化调控剂开发功能菌株选择的依据。05101520256121824303642485460蛋白酶活性/(U g-1)时间/hGXZY9GXZY7GXZY3CK图3产蛋白酶活性菌株发酵液中的酶活性变化2.4产蛋白酶菌株GXZY9的鉴定选取在发酵过程中酶活性下降幅度最小的GXZY9 进行多相分类学鉴定。结果显示，形态特征：将菌株GXZY9在LB培养基形成的菌落观察可见，菌落表面粗糙，有皱褶，不透明，微黄，无荚膜，有鞭毛（图 4A）；革兰氏阳性，芽孢（0.50.8）m（11.4）m，位于菌体中央或稍偏（图4B）；大小为（0.50.7）m（1.52.5）m（图4C）。A为菌落形态；B为光镜下菌体形态；C为电镜下超微形态图1GXZY9菌株的形态特征根据形态特征推测GXZY9可能为枯草芽孢杆菌，故拟以枯草芽孢杆菌标准菌株为参比菌株，对GXZY9菌株进行部分生理生化特征
